Les lymphocytes T régulateurs périphériques CD4 + CD25hiCD127low sont augmentés chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal

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Les lymphocytes T régulateurs périphériques CD4 + CD25hiCD127low sont augmentés chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal

BMC Gastroentérologie

BMC Gastroenterology volume 23, Article number: 168 (2023) Citer cet article

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Détails des métriques

Les cellules T régulatrices (Tregs) jouent un rôle important dans la régulation de la réponse immunitaire et de la tolérance immunologique dans le cancer. Le cancer gastro-intestinal demeure l'une des principales causes de décès liés au cancer dans le monde. Cette étude visait à détecter les Tregs chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal.

Dans cette étude, 45 patients atteints d'un cancer gastrique, 50 patients atteints d'un cancer colorectal et 50 témoins sains ont été recrutés. La cytométrie en flux a été utilisée pour détecter les cellules CD4+CD25hiCD127low Tregs, CD4+CD25hi et CD4+ dans le sang périphérique. La cytokine interleukine-10 (IL-10) et le facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) dans le sang périphérique et dans le surnageant des cultures de Tregs ont été mesurés par dosage immuno-enzymatique.

Par rapport aux témoins sains, les niveaux de CD4+CD25hiCD127low Tregs et de cellules CD4+CD25hi ont augmenté de manière significative chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal. Les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal ont également montré une augmentation significative des taux d'IL-10 et de TGF-β1 dans le sang périphérique et dans le milieu de culture CD4 + CD25hiCD127low Tregs.

La présente étude a d'abord démontré que les patients gastro-intestinaux ont un statut immunitaire compromis où les Tregs CD4 + CD25hiCD127low, ainsi que les niveaux d'IL-10 et de TGF-β1 sont élevés. Les données ont offert de nouvelles informations pour comprendre les caractéristiques immunologiques des patients gastro-intestinaux, ainsi que de nouvelles informations sur les approches pour développer de nouvelles immunothérapies pour les patients atteints de cancer gastro-intestinal.

Rapports d'examen par les pairs

Les tumeurs carcinoïdes gastro-intestinales (GI) sont utilisées collectivement pour désigner les cancers du tube digestif et comprennent les cancers de l'estomac, du pancréas, colorectal et anal, dont le cancer gastrique (GC) et le cancer colorectal (CRC) représentent la grande majorité. Les cancers gastro-intestinaux sont des tumeurs malignes courantes et l'une des principales causes de décès par cancer dans le monde. Par exemple, le GC est le troisième cancer le plus fréquent chez les hommes et le cinquième chez les femmes, et reste l'une des principales causes de décès liés au cancer [1, 2] et le CCR est le deuxième cancer le plus fréquemment diagnostiqué chez les femmes et le troisième chez les hommes [ 3], qui impose un fardeau sanitaire considérable à l'échelle mondiale. Ces dernières années, avec le développement de la recherche en immunologie tumorale, l'incapacité du système immunitaire à éradiquer la tumeur est l'une des caractéristiques fondamentales du cancer [4,5,6]. Les tumeurs exploitent de multiples mécanismes pour supprimer l'immunité de l'hôte et favoriser l'évasion immunitaire. L'échappement immunitaire ainsi que les points de contrôle immunitaires jouent un rôle clé dans la survenue, le développement, l'invasion et la métastase de nombreux cancers [4,5,6].

De nombreuses études ont rapporté le rôle des cellules T régulatrices (Tregs) pour aider les tumeurs à échapper à la surveillance immunitaire [7, 8]. Les Tregs, un sous-ensemble de lymphocytes T, sont d'une grande importance dans la régulation de l'immunité tumorale et de l'auto-immunité favorisant la progression tumorale en supprimant l'immunité antitumorale efficace [7, 8]. Les Tregs naturels représentent environ 5 % du sous-ensemble de cellules CD4+ dans le sang périphérique et expriment de manière constitutive des niveaux élevés de CD25 de haute affinité. Récemment, les Tregs ont été identifiés comme des cellules T CD4 + CD25hi avec de faibles niveaux de CD127 exprimant un phénotype de surface cellulaire CD4 + CD25hi CD127low [9, 10]. Les Tregs peuvent également induire un microenvironnement immunosuppresseur qui bloque le succès de l'immunothérapie tumorale [11, 12]. Les Tregs peuvent exercer leurs effets immunosuppresseurs en stimulant la sécrétion du facteur de croissance transformant-β1 (TGF-β1) et de l'interleukine-10 (IL-10) [13,14,15]. Le TGF-β1 est un puissant suppresseur du système immunitaire, qui est également au cœur de la suppression immunitaire dans le microenvironnement tumoral [13]. Des études récentes ont révélé que le TGF-β1 favorisait la progression, l'invasion et les métastases dans le cancer gastro-intestinal et pouvait également être associé au pronostic [16, 17]. L'IL-10 est reconnue pour inhiber l'activation et la fonction effectrice des lymphocytes T, des monocytes et des macrophages. Il s'agit donc d'une cytokine multifonctionnelle aux effets divers sur l'immunité et le cancer [18].

Bien que de nombreuses études aient rapporté une augmentation significative de la sous-population CD4 + CD25hiCD127low dans certaines tumeurs [9, 19], les informations sur les Tregs dans le cancer gastro-intestinal sont très limitées. La détection des Treg périphériques CD4 + CD25hiCD127low et des cytokines associées aiderait à évaluer et à comprendre de manière exhaustive la fonction de l'immunité des patients sous plusieurs angles, afin de guider la pratique clinique pour mener une pré-évaluation plus globale. Par conséquent, dans cette étude, nous avons cherché à détecter les niveaux de CD4 + CD25hiCD127low Tregs, TGF-β1 et IL-10 pour évaluer le statut d'immunosuppression chez les patients atteints de cancer gastro-intestinal, fournirait des informations utiles pour le développement d'immunothérapies efficaces contre le cancer gastro-intestinal.

Le cancer gastrique (GC, N = 45) et le cancer colorectal (CRC, N = 50) ont été recrutés au Département d'oncologie, Hôpital affilié de la ville scientifique et technologique de Suzhou de l'Université médicale de Nanjing de juillet 2016 à juillet 2020. Les critères suivants avaient à remplir pour l'inclusion : 1) Diagnostic avec fibroscopie ou coloscopie ; 2) Aucune radiochimiothérapie, thérapie immunomodulatrice, glucocorticoïdes ou traitement médicamenteux non stéroïdien dans les deux mois ; 3) Compléter les informations cliniques. Les patients qui répondaient à l'un des critères suivants seraient exclus : 1) ont reçu une radiochimiothérapie, un traitement immunomodulateur, des glucocorticoïdes ou un traitement médicamenteux non stéroïdien dans les deux mois ; 2) Patients souffrant d'une infection aiguë, d'une inflammation chronique à long terme ou d'autres maladies du système immunitaire ; 3) Aucun diagnostic pathologique ; 4) Informations cliniques incomplètes. Simultanément, 50 personnes en bonne santé, déterminées par un examen physique, ont été sélectionnées pour le groupe de contrôle de la santé (HC, N = 50). Le stade pathologique du GC et du CCR a été classé en stades I, II, III et IV selon la 8e édition du système de stadification UICC/AJCC TNM. Le stade TMN était composé de la profondeur de l'invasion tumorale (T), des métastases ganglionnaires régionales (N) et des métastases à distance (M). Dans cette étude, les patients ont été divisés en un groupe de stade précoce (I + II) et un groupe de stade avancé (III + IV). De plus, selon la classification histopathologique du cancer gastro-intestinal de l'Organisation mondiale de la santé (OMS), la différenciation tumorale a également été classée en trois grades : faible, modéré et élevé. Les caractéristiques cliniques de tous les participants ont été détaillées dans le tableau 1. Huit à dix millilitres de sang veineux périphérique tôt le matin provenant de participants à jeun ont été prélevés avec des tubes de prélèvement sanguin sous vide anticoagulation à l'héparine, puis ont été entièrement mélangés avec de l'EDTA pour l'anticoagulation. Les échantillons ont ensuite été conservés à température ambiante et colorés dans les 6 heures. Tous les sujets de recherche ont participé volontairement à ce projet et ont signé un formulaire de consentement éclairé. De plus, l'étude a été approuvée par le comité d'éthique de l'hôpital de Suzhou affilié à l'université médicale de Nanjing.

Pour préparer les échantillons pour la cytométrie en flux, 100 μl de sang total anticoagulé sur EDTA ont été prélevés dans un tube à essai en flux dédié. Les cellules ont été colorées in vitro en utilisant la méthode d'exclusion au bleu trypan, et le pourcentage de cellules vivantes devait être supérieur à 99 %. Des quantités appropriées d'anticorps monoclonaux marqués par fluorescence (anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC et anti-CD127-PE) ont ensuite été ajoutées et les échantillons ont été mélangés. Les cellules ont été incubées à température ambiante pendant 15 min dans l'obscurité. Ensuite, les globules rouges ont été lysés, incubés dans l'obscurité pendant 12 min, puis centrifugés à 1500 tr/min pendant 5 min. Les surnageants ont été jetés et le culot cellulaire résultant a ensuite été remis en suspension dans 1 ml de solution saline tamponnée au phosphate (PBS). Les cellules ont été centrifugées à nouveau pendant 5 min à 1500 tr/min, après quoi le surnageant a été jeté. Enfin, 400 μl de PBS ont été ajoutés au culot cellulaire final et les cellules ont été examinées sur un cytomètre en flux (FACSCalibur, BD Biosciences, Californie, États-Unis). Les tubes témoins ont été colorés selon la même procédure que celle utilisée pour le groupe expérimental. La présence de cellules CD4+, CD4+CD25hi et CD4+CD25hiCD127low a ensuite été analysée à l'aide du logiciel d'analyse FACSDiva (BD Biosciences, Californie, USA). Les anticorps monoclonaux anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC et anti-CD127-PE et les contrôles négatifs appropriés (souris IgG1-FITC, IgG1-APC et IgG1-PE) ont tous été obtenus auprès de BD Biosciences-Pharmingen.

Un dosage immuno-enzymatique (ELISA) a été utilisé pour déterminer les niveaux d'IL-10 et de TGF-β1 dans le sérum du sang périphérique. En bref, des plaques à 96 puits ont été lavées trois fois avec un laveur de plaques automatique. Après séchage, des solutions de tampon analytique et de série standard ont été ajoutées aux puits, et 60 μl de tampon analytique ont été séquentiellement versés goutte à goutte dans les puits restants. Les anticorps conjugués à l'enzyme ont été versés dans chaque puits, puis les plaques ont été incubées pendant 1,5 h à 22 ° C. Ensuite, les puits ont été lavés 3 fois (chaque fois dure 5 min) avec du PBS. Chaque puits a été recouvert de 80 µl de solution de peroxydase de raifort (HRP)-streptavidine. La plaque a été incubée à température ambiante pendant 1,5 h et lavée 3 fois avant séchage. Ensuite, 100 μl d'agent chromogène ont été versés dans les puits et les plaques ont été incubées à 20 ° C pendant 15 min. La densité optique a été mesurée à 450 nm avec un lecteur de microplaques et les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 ont été calculées.

Pour l'IL-10 et le TGF-β1 dans un milieu de culture Tregs, une centrifugation en gradient de densité de Ficoll a été utilisée pour obtenir des cellules mononucléaires du sang périphérique (PBMC) à partir de 5 ml de sang périphérique. Des anticorps fluorescents anti-CD4-FITC, anti-CD25-APC et anti-CD127-PE ont été utilisés pour marquer les cellules. Les Treg CD4 + CD25hiCD127low de haute pureté ont été séparés par cytométrie en flux. Les Tregs ont été cultivés dans du milieu RPMI-1640 contenant 10 % de sérum bovin fœtal, et 1 × 10 [6] ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque à 96 puits recouverte d'anticorps CD3. L'anticorps monoclonal anti-CD28 (1 ug/ml) et l'IL-2 (500 ug/ml) ont été ajoutés à chaque puits. Après avoir été cultivés pendant 3 et 5 jours, les surnageants ont été collectés pour mesurer les niveaux d'IL-10 et de TGF-β1 via ELISA.

Les données ont été exprimées en moyenne ± erreur standard de la moyenne (SEM). Les données ont été analysées par le test t de Student (GraphPad Software, San Diego, CA, USA). Les résultats avec une valeur P < 0,05 ont été considérés comme statistiquement significatifs.

Dans cette étude, il y avait 23 hommes et 22 femmes âgés de 32 à 72 ans (57,8 ± 6,9) atteints d'un cancer gastrique. Les 50 patients atteints de cancer colorectal que nous avons sélectionnés comprenaient 28 hommes et 22 femmes, âgés de 47 à 73 (57,6 ± 3,2) ans (Tableau 1). Les personnes du groupe témoin en bonne santé ont été sélectionnées dans le centre d'examen physique.

Pour évaluer l'immunosuppression des patients gastro-intestinaux, les Tregs CD4+CD25hiCD127low dans le sang périphérique ont été détectés par cytométrie en flux. Un diagramme de dispersion de cytométrie en flux montre les pourcentages de Tregs périphériques CD4 +, CD4 + CD25hi et CD4 + CD25hiCD127low chez les patients atteints de GI ou de témoins sains (Fig. 1A-C). Comme le montrent les Fig. 2A-C et le Tableau 2, par rapport aux témoins sains (HC), la proportion de CD4+CD25hi périphériques et de CD4+CD25hiCD127lowTregs a remarquablement augmenté dans le groupe GC (CD4+CD25hi : GC vs HC ; 13,11 ± 0,58 vs 6,01 ± 0,33, P = 0,0008 ; CD4+CD25hiCD127low : GC vs HC ; 2,81 ± 0,36 vs 1,68 ± 0,14, P = 0,0007) et groupe de patients CCR (CD4+CD25hi : CRC vs HC ; 12,09 ± 0,69 vs 6,01 ± 0,33, P = 0,0009 ; CD4+CD25hiCD127low : CRC vs HC ; 2,56 ± 0,18 vs 1,68 ± 0,14, P = 0,0007), tandis que les pourcentages de cellules CD4+ périphériques ont diminué dans le GC (GC vs HC ; 33,95 ± 1,27 vs 38,72 ± 0,73, P = 0,0009) ou patients CCR (CRC vs HC ; 35,94 ± 1,01 vs 38,72 ± 0,73, P = 0,0233) (Fig. 2A-C). Notamment, le rapport du sous-ensemble élargi des cellules CD4 + CD25hi, ou CD4 + CD25hi CD127low Tregs aux cellules CD4 + a été déterminé davantage; Les patients GC et CRC ont démontré une augmentation du ratio par rapport aux donneurs sains (Fig. 2D-E).

Diagramme de dispersion de cytométrie en flux de patients atteints d'un cancer gastro-intestinal et de témoins sains. A gauche : R1, un nuage de points de lymphocytes ; milieu : les lymphocytes T CD4+ ont été contrôlés par R1 ; à droite : CD4+CD25hiCD127low Tregs ont été mis en place avec CD4+. HC, contrôle sain ; GC, cancer gastrique ; CCR, cancer colorectal

Les Tregs CD4+CD25hiCD127low étaient régulés positivement chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal. A Pourcentage de cellules CD4+ parmi les patients et les témoins sains. B Pourcentage de cellules CD4+CD25hi parmi les patients et les témoins sains. C Pourcentage de cellules CD4+CD25hiCD127low parmi les patients et les témoins sains. D Pourcentage de cellules CD4+CD25hi parmi les cellules CD4+. E Pourcentage de cellules CD4+CD25hiCD127low parmi les cellules CD4+. HC, contrôle sain (N = 50) ; GC, cancer gastrique (N = 45) ; CCR, cancer colorectal (N = 50). N, nombre de patients ou témoins sains. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SEM et analysées par le test t de Student. *, P < 0,05 ; **, P < 0,01 ; ***, P < 0,001

Étant donné que les Tregs peuvent exercer leurs effets immunosuppresseurs en stimulant la production de TGF-β1 et d'IL-10, les concentrations des deux cytokines dans le sang périphérique ont été déterminées pour mieux évaluer l'état immunosuppresseur des patients. Par rapport à celles des témoins sains, les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 ont augmenté significativement dans le sang périphérique du GC (IL-10 : GC vs HC ; 4,28 ± 0,09 vs 2,09 ± 0,15, P = 0,0006 ; TGF- β1 : GC vs HC ; 28,51 ± 0,34 vs 15,02 ± 0,31, P = 0,0008) et patients atteints de CCR (IL-10 : CRC vs HC ; 4,01 ± 0,12 vs 2,09 ± 0,15, P = 0,0008 ; TGF-β1 : CRC vs HC : 26,07 ± 0,29 vs 15,02 ± 0,31, P = 0,0005) (Fig. 3A-B et Tableau 3).

Augmentation de l'IL-10 et du TGF-β1 chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal. A et B Concentration d'IL-10 et de TGF-β1 dans le sang périphérique des patients et des témoins sains. Concentrations d'IL-10 C et D et de TGF-β1 dans le surnageant de Tregs. HC, contrôle sain (N = 50) ; GC, cancer gastrique (N = 45) ; CCR, cancer colorectal (N = 50). N, nombre de patients ou témoins sains. Les données ont été présentées sous forme de moyennes ± SEM et analysées par le test t de Student. ***, P < 0,001

Pour déterminer davantage la relation entre les deux cytokines et les Tregs CD4 + CD25hiCD127low, les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 dans les Tregs CD4 + CD25hiCD127low en culture ont également été détectées par ELISA. Par rapport au groupe sain, les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 dans les Tregs CD4 + CD25hiCD127low ont augmenté de manière significative dans le sang périphérique des patients GC et CRC (Fig. 3C-D et Tableau 4).

Bien que des efforts de recherche concentrés sur le cancer gastro-intestinal aient émergé, les effets de la chirurgie traditionnelle, de la chimiothérapie et de la radiothérapie sont limités, et un grand nombre de patients atteints de cancer gastro-intestinal développent encore une récidive locale et des métastases à distance après avoir reçu ces traitements. Parce que l'immunothérapie actuelle pour le cancer gastro-intestinal reste insuffisante, il existe un grand besoin d'obtenir des informations utiles pour développer de nouvelles cibles thérapeutiques dans le cancer gastro-intestinal. Dans la présente étude, nous avons constaté que, par rapport aux témoins sains, les CD4+CD25hiCD127low Tregs, les cellules CD4+CD25hi et les cytokines apparentées, IL-10 et TGF-β1, étaient significativement augmentés chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal.

La réponse immunitaire dans le développement, la récurrence et surtout le traitement du cancer est d'une grande importance. Les Tregs CD4+CD25hiCD127low participent à l'auto-tolérance immunitaire et à la régulation de l'homéostasie immunitaire au cours de la réponse immunitaire physiopathologique [20]. De nombreuses études ont démontré qu'un grand nombre de Tregs CD4 + CD25hiCD127low s'infiltrent dans divers types de tumeurs chez l'homme, y compris le cancer du tractus gastro-intestinal [21,22,23,24]. De plus, les Tregs sont généralement considérés comme des immunomodulateurs clés qui maintiennent la tolérance immunitaire et induisent un microenvironnement immunosuppresseur [20, 23]. Pour évaluer le microenvironnement immunosuppresseur des patients atteints de cancer gastro-intestinal, nous avons utilisé la cytométrie en flux pour détecter les cellules CD4+ périphériques et les CD4+CD25hiCD127low Tregs, et les résultats ont démontré que les cellules CD4+CD25hiCD127low Tregs et CD4+CD25hi augmentaient significativement chez les patients atteints de cancer gastro-intestinal par rapport aux patients sains. groupe.

Les Tregs CD4+CD25hiCD127low peuvent réguler leurs effets suppresseurs en stimulant la production d'IL-10 et de TGF-β1 [13,14,15]. L'IL-10 est étroitement liée au développement et au pronostic du cancer gastro-intestinal [25,26,27]. L'IL-10 module distinctement le comportement des cellules cancéreuses gastro-intestinales, en raison de profils protéolytiques distincts qui ont eu un impact sur l'invasion cellulaire et l'angiogenèse, et une expression élevée d'IL-10 s'est avérée significativement associée à un pronostic plus sombre chez les patients gastro-intestinaux [26, 27]. La sécrétion de TGF-β1 par les macrophages associés aux tumeurs favorise la prolifération, l'invasion et la métastase du cancer gastro-intestinal [28, 29]. En combinaison, des expressions élevées d'IL-10 et de TGF-β1 favorisent le développement d'un cancer gastro-intestinal, de métastases tumorales et conduisent à un pronostic plus sombre. Cette étude a également mesuré les concentrations d'IL-10 et de TGF-β1 dans le sang périphérique et dans les CD4 + CD25hiCD127low Tregs en culture chez des patients atteints d'un cancer gastro-intestinal, et a révélé que les deux cytokines étaient significativement plus élevées chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal que chez les témoins sains. Ces données suggèrent ensemble que l'augmentation des CD4 + CD25hiCD127low Tregs, accompagnée d'une augmentation de l'IL-10 et du TGF-β1 chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal, pourrait jouer un rôle dans le développement et le pronostic du cancer gastro-intestinal.

De plus, nos recherches précédentes ont prouvé que les Tregs CD4 + CD25hiCD127low dans le sang périphérique avaient une grande valeur pour la sélection d'options de traitement individualisées appropriées pour les patients atteints d'un cancer du poumon non à petites cellules [19]. De plus, l'expression de PD-L1 à la surface des Tregs périphériques CD4+CD25hiCD127low était significativement augmentée chez les patients atteints d'un carcinome hépatocellulaire primitif, en particulier chez les patients atteints d'une maladie avancée, ce qui suggère que l'expression élevée de PD-L1 à la surface des CD4+CD25hiCD127low Les Tregs peuvent être liés à la progression tumorale et au pronostic du patient [24]. Par conséquent, la détermination de l'expression de PD-L1 à la surface des Tregs CD4 + CD25hiCD127low dans le cancer gastro-intestinal améliorerait notre compréhension de la relation entre les Tregs CD4 + CD25hiCD127low et le traitement ou le pronostic des patients gastro-intestinaux. De telles études font actuellement l'objet d'investigations intensives en cours dans notre laboratoire.

En conclusion, les résultats actuels ont d'abord indiqué que les patients gastro-intestinaux ont un statut immunitaire compromis où les cellules CD4 + sont réduites et les Tregs CD4 + CD25hiCD127low sont élevés. Les Treg périphériques CD4 + CD25hiCD127low pourraient être utilisés pour l'évaluation du statut immunosuppresseur des patients atteints d'un cancer gastro-intestinal et pourraient aider à évaluer l'efficacité potentielle des immunothérapies tumorales dans le cancer gastro-intestinal. Les thérapies ciblées sur les CD4+CD25hiCD127low Tregs, l'IL-10 et le TGF-β1 chez les patients atteints d'un cancer gastro-intestinal auraient une grande importance clinique dans l'individualisation et l'optimisation du traitement à l'avenir.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Cellules T régulatrices

Cytokine interleukine-10

Facteur de croissance transformant-β1

Les tumeurs carcinoïdes gastro-intestinales

Cancer de l'estomac

Cancer colorectal

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