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Mar 18, 2023

Les analogues de 25OHD et les tubes de prélèvement sanguin sous vide affectent considérablement la précision des dosages immunologiques automatisés

Rapports scientifiques tome 5,

Rapports scientifiques volume 5, Numéro d'article : 14636 (2015) Citer cet article

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Les variations dans les méthodes de quantification de la vitamine D sont importantes et les influences des analogues de la vitamine D et des méthodes de prélèvement sanguin n'ont pas été systématiquement examinées. Nous avons évalué les effets des analogues de la vitamine D 25OHD2 et 3-epi 25OHD3 et des méthodes de prélèvement sanguin sur la mesure de la vitamine D, à l'aide de cinq systèmes d'immunodosage et de la chromatographie liquide-spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS). Des échantillons de sérum (332) ont été sélectionnés à partir de demandes de dosage de vitamine D de routine, y compris des échantillons avec ou sans 25OHD2 ou 3-epi 25OHD3 et analysés à l'aide de divers systèmes d'immunodosage. Dans les échantillons sans 25OHD2 ou 3-epi 25OHD3, tous les dosages immunologiques étaient bien corrélés avec LC-MS/MS. Cependant, le système Siemens a produit un biais moyen positif important de 12,5 ng/mL et une faible valeur Kappa lors de l'utilisation de tubes avec activateur de coagulation et séparateur de gel. En présence de 25OHD2 ou de 3-épi 25OHD3, les corrélations et la concordance clinique ont diminué pour tous les dosages immunologiques. Le sérum 25OHD dans des tubes VACUETTE avec gel et activateur de coagulation, tel que mesuré par le système Siemens, a produit des valeurs significativement plus élevées que les échantillons collectés dans des tubes VACUETTE sans additifs. Le biais a diminué et la concordance clinique s'est améliorée de manière significative lors de l'utilisation de tubes sans additifs. En conclusion, la plupart des immunoessais automatisés ont montré une corrélation et un accord acceptables avec LC-MS/MS ; cependant, les analogues de 25OHD et les tubes de prélèvement sanguin ont considérablement affecté la précision.

Des preuves récentes de l'association entre la vitamine D et les maladies osseuses1, le diabète2, les maladies auto-immunes3, les maladies cardiovasculaires4 et le cancer5, associées à la reconnaissance que la carence en vitamine D est courante, ont conduit à une augmentation massive des tests de vitamine D dans le monde1,6,7. Par exemple, à la clinique Mayo, les tests de carence en vitamine D ont augmenté de 80 à 90 % par an6 et dans notre laboratoire, le nombre de tests administrés a doublé au cours des deux dernières années. En raison de cette charge de travail accrue, des immunoessais automatisés ont récemment été développés. Cependant, il existe une grande variation entre les méthodes utilisées pour tester les niveaux de vitamine D6,8,9.

La 25 hydroxyvitamine D circulante (25OHD) est la forme prédominante de vitamine D et est généralement considérée comme le biomarqueur le plus fiable de la concentration sérique de vitamine D10. La 25OHD3 et la 25OHD2 sont les deux principaux types de 25OHD : la 25OHD3 est produite de manière endogène chez les animaux dans la peau en réponse à l'exposition au soleil et peut être obtenue dans l'alimentation par le biais de suppléments contenant de la 25OHD3. 25OHD2 se trouve dans les champignons. Le 25OHD2 ou le D3 peuvent être utilisés dans des suppléments ou comme additifs à des aliments tels que les produits laitiers1. Cependant, le 3-épi 25OHD3, un épimère du 25OHD3, a récemment été identifié. Alors que la bioactivité de cet analogue n'est toujours pas claire11,12, il a été démontré que la 3-épi 25OHD3 provoque une réactivité croisée avec la 25OHD3 dans les dosages immunologiques, conduisant à une surestimation des niveaux de 25OHD.

Divers dosages immunologiques automatisés ont été développés pour la détection de 25OHD. Cependant, la variation entre les laboratoires a été signalée comme étant aussi élevée que 38 %6,8,13. De plus, la définition de la carence en vitamine D est toujours controversée, avec de grandes variations entre les méthodes contribuant à la controverse. Ces grandes variations devraient également être problématiques pour les applications de diagnostic clinique utilisant le même seuil de carence en vitamine D pour différentes méthodes. Par conséquent, l'uniformité clinique des différentes méthodes doit être évaluée.

La chromatographie liquide à dilution isotopique et la spectrométrie de masse en tandem (LC-MS/MS) sont considérées comme la méthode de référence et la méthode de référence pour les tests 25OHD14. Cependant, les approches LC-MS/MS les plus couramment utilisées et celles qui ont servi de base pour comparer les méthodes n'ont pas inclus la séparation du 3-epi 25OHD3 du 25OHD3 car cela nécessiterait une analyse fastidieuse par chromatographie, ce qui diminuerait l'efficacité de la détection ; ce n'est que dans des études isolées que le 3-epi 25OHD3 a été mesuré par LC-MS/MS14,15.

Plusieurs études ont comparé les méthodes de détection de la vitamine D au cours des dernières années ; cependant, la question de savoir si ces méthodes répondent aux normes de performance est controversée. En 2012, Farrell et al.8 ont comparé les performances de cinq immunoessais automatisés avec la LC-MS/MS et ont conclu que le système Roche n'atteignait pas les objectifs de performance minimaux, tandis qu'Ajuria-Morentin et al.9 ont rapporté que le système Siemens avait le biais le plus important par rapport à la LC-MS/MS, sans explication claire de ce biais. Les suppléments de vitamine D2 et de vitamine D3 sont largement utilisés en Chine et aux États-Unis d'Amérique (USA), l'identification de concentrations importantes de 25OHD2 et 3-épi 25OHD311 en circulation a conduit certains fabricants, comme Roche, à mettre à jour leurs produits pour améliorer efficacité de détection et de quantification pour des analogues distincts. Cependant, ces nouveaux immunodosages peuvent être limités par la réactivité croisée des anticorps et la reconnaissance non équimolaire de 25OHD2 et 25OHD3. De plus, aucune étude n'a évalué les effets de la 25OHD2 et de la 3-épi 25OHD3 sur les performances de la dernière génération de systèmes d'immunodosage 25OHD. En tant que complication supplémentaire de la mesure précise de la 25OHD, l'utilisation de tubes de prélèvement sanguin sous vide n'est pas normalisée et différents tubes de prélèvement peuvent affecter la précision des dosages immunologiques.

Dans cette étude, nous avons comparé cinq immunoessais automatisés, dont Roche Cobas E601 (Roche Diagnostics (Shanghai) Ltd., Bâle, Suisse), Siemens ADVIA Centaur XP (Siemens Healthcare Diagnostics (Shanghai) Co., Walpole, États-Unis), DiaSorin Liaison XL ( DiaSorin, Saluggia, Italie), Abbott Architect I4000 (Abbott Diagnostics, Deerfield, IL, USA) et IDS-iSYS (IDS France, Pouilly en Auxois, France) avec une méthode de référence LC-MS/MS pour évaluer les effets du 25OHD2 et 3-epi 25OHD3 sur la précision des cinq dosages immunologiques automatisés et pour déterminer l'influence des additifs dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide sur la détection de 25OHD.

D'avril à juin 2014, 332 échantillons de sérum de 106 hommes et 226 femmes, âgés de 6 mois à 93 ans (moyenne ± SD ; 46 ± 22 ans), ont été prélevés à partir de demandes de dosage de vitamine D de routine. Les échantillons ont été prélevés à l'aide de tubes VACUETTE de 4 mL avec gel et activateur de coagulation (REF : 454067 ; Greiner Bio-one, Kremsmunster, Autriche), dont 166 échantillons de sérum contenant du 25OHD3 (4,3 à 57,4 ng/mL), 111 échantillons de sérum contenant du 25OHD2 ( 2,5–78,4 ng/mL), 31 échantillons de sérum contenant du 3-épi 25OHD3 (2,2–8,8 ng/mL) et 24 échantillons contenant à la fois du 25OHD2 (3,2–18,8 ng/mL) et du 3-épi 25OHD3 (2,2–5,4 ng/mL ), ainsi que 25OHD3. Au moment de cette étude, la LC-MS/MS était utilisée dans notre laboratoire et servait à sélectionner les échantillons pour cette étude. Les échantillons de sérum ont été divisés en six aliquotes et conservés à -80 °C pour assurer la stabilité jusqu'à l'analyse16,17.

Pour étudier les effets possibles des additifs dans les tubes de prélèvement sanguin sous vide sur la mesure de 25OHD, 77 volontaires sains ont été recrutés et des échantillons de sang à jeun ont été prélevés sur chaque individu par ponction veineuse dans des tubes sans additif VACUETTE de 4 ml (REF : 454001 ; Greiner Bio- un); les échantillons ont ensuite été centrifugés dans les 2 h (1200 × g, 10 min) et immédiatement analysés à l'aide de systèmes d'immunodosage automatisés et de LC-MS/MS.

Nous avons utilisé LC-MS/MS pour mesurer 25OHD et pour évaluer les cinq systèmes automatisés d'immunodosage par chimiluminescence. De plus, trois pools de sérum ont été préparés pour l'évaluation de la précision du test. La méthode LC-MS/MS a démontré des concentrations moyennes de 25OHD de 6,2, 16,0 et 22,1 ng/mL, respectivement, pour les trois pools, avec des concentrations de 25OHD2 et 3-épi 25OHD3 inférieures à 2,5 ng/mL. Plusieurs aliquotes des trois pools ont été préparées et stockées à -80 ° C. Pendant 5 jours consécutifs, une aliquote fraîchement décongelée de chaque pool a été testée quatre fois en utilisant toutes les méthodes.

L'étude a été examinée et approuvée par le comité d'éthique du Peking Union Medical College Hospital et les expériences ont été réalisées conformément aux directives approuvées. Tous les individus étudiés ont été informés par écrit de l'utilisation prévue de leurs échantillons et chacun a fourni son consentement écrit.

La LC-MS/MS a été réalisée à l'aide d'un système Waters ACQUITY UPLC (Waters Corporation, Milford, MA, USA) en tandem avec un système AB Sciex 4000 QTrap (Sciex Applied Biosystems, Foster City, CA, USA). Le protocole de préparation des échantillons était le suivant. Les échantillons de sérum, les étalons et les contrôles ont été traités avec de l'hydroxyde de sodium 0,1 mM et précipités avec une solution de sulfate de zinc 1 mM et du méthanol contenant des étalons internes d'isotopes marqués au deutérium. Le 25OHD a finalement été extrait avec de l'hexane, soigneusement vortexé puis centrifugé pendant 10 min à 4 ° C à 3148 × g. La phase supérieure d'hexane a ensuite été transférée dans des flacons en verre et séchée sous azote à 40 ° C pendant 25 min et le résidu séché a été reconstitué dans 150 μL de méthanol/eau (70:30) et chargé sur le système LC-MS/MS. La séparation chromatographique par LC-MS/MS a été réalisée à l'aide d'une colonne analytique Phenomenex Kinetex PFP (100 × 3,0 mm, 2,6 μm ; Phenomenex Inc. Torrance, CA, USA) avec du méthanol comme phase mobile A et 0,1 % d'acide formique dans l'eau comme mobile. phase B. Le gradient isocratique était le suivant : 0–2,0 min, 70 % A ; 2,0–5,0 min, 70 %–75 % A ; 5,0–6,5 min, 75 % A ; 6,5–10,0 min, 75 %–80 % A ; 10,0–11,0 min, 80 % A ; 11.01–12.0 min, 90 % A ; et 12,01–13,0 min, 70 % A. Le débit était de 0,5 mL/min. Le four à colonne a été maintenu à 45°C tout au long de l'analyse. L'analogue deutéré de 25OHD3 a été utilisé comme étalon interne pour 3-épi 25OHD3 et 25OHD3 et l'analogue deutéré de 25OHD2 a été utilisé comme étalon interne pour 25OHD2. La détection MS/MS a été opérée en mode d'ionisation par électrospray positif. Le mode de fonctionnement MRM (Multiple Reaction Monitoring) a été utilisé et les transitions MRM utilisées pour chaque analyte étaient les suivantes : m/z 413,3 → 395,3 (25OHD2), 401,4 → 383,4 (25OHD3), 416,3 → 398,3 (étalon interne 25OHD2, [ 2H]3-25OHD2) et 404,4 → 386,4 (étalon interne 25OHD3, [2H]3-25OHD3). Les courbes d'étalonnage ont été construites en traçant le rapport des aires des pics de chromatographie pour 25OHD2 et 25OHD3 et leurs étalons internes respectifs par rapport aux concentrations connues, suivi d'une régression linéaire pour s'adapter aux données. Les limites de quantification (LOQ) pour 25OHD2 et 25OHD3 étaient de 1,8 et 1,2 ng/mL, respectivement. Le niveau spécifique de 3-epi 25OHD3 a été quantifié en utilisant l'étalonnage de 25OHD3 et de [2H]3-25OHD3 comme étalons internes. Un chromatographe représentatif est illustré à la figure supplémentaire 1. La plage de linéarité pour 25OHD3 et 25OHD2 était de 2,5 à 200 ng/mL et les deux courbes d'étalonnage ont produit un coefficient de corrélation supérieur à 0,999. La précision a été validée par l'analyse du National Institute of Standards and Technology (NIST) SRM 972a. Par rapport aux valeurs de référence du SRM 972a, la précision de la LC-MS/MS pour les mesures de 25OHD2, 25OHD3 et 3-epi 25OHD3 était de 104,5 %–106,8 %, 99,5 %–105,9 % et 108,0 %–109,9 %, respectivement. La récupération a été estimée en dopant des échantillons de sérum avec deux niveaux de 25OHD2 et 25OHD3 et en analysant en triple. La récupération a été calculée comme le rapport de la valeur mesurée et de la quantité d'étalon utilisée pour enrichir l'échantillon. Les récupérations moyennes pour 25OHD2 et 25OHD3 étaient toutes proches de 100 %. La précision a été évaluée en analysant trois niveaux d'échantillons de contrôle qualité de Bio-Rad (LiquichekTM Specialty Immunoassay Control, LOT : 57440). Les coefficients de variation (CV) totaux pour le 25OHD2 et le 25OHD3 étaient respectivement de 4,34 % (2,88 % à 7,01 %) et de 2,82 % (2,45 % à 3,21 %).

Les méthodes d'immunodosage ont été réalisées sur les plateformes Roche, Siemens, DiaSorin, Abbott et IDS, y compris Roche Elecsys Vitamin D Total (Lot : 171102, Instruction for Use(IFU) version : 06268668001V1,02/2011), Siemens ADVIA Centaur Vitamin D Total ( Lots : 39566029, 10631021 ; version IFU : 10699313, 08/2012), DiaSorin Liaison XL Total Vitamin D (Lot : 131192E ; version IFU : zh310600 43005, 09/2014), Abbott Architect 25-OHD Vitamin D (Lot : 02614E00 0 ; version IFU : 49-8941/R02,05/2012) et IDS-iSYS (Lot : 1996 ; version IFU : IS-2700SPL V02,05/2014), respectivement.

Les données ont été analysées par régression de Passing-Bablok et tracés de Bland-Altman pour évaluer les comparaisons entre les méthodes. Le test t apparié a été utilisé pour comparer les résultats 25OHD entre les méthodes. Le seuil de carence en vitamine D était de 20 ng/mL1,18. La concordance entre les méthodes a été évaluée à l'aide de la concordance inter-juges (valeurs Kappa)9. Les coefficients Kappa ont été calculés pour évaluer le niveau de concordance entre les différentes méthodes pour identifier l'hypovitaminose cliniquement pertinente (20 ng/mL). Les valeurs de Kappa supérieures à 0,6 indiquaient un accord, tandis que les valeurs supérieures à 0,8 indiquaient un excellent accord9. La précision a été exprimée en pourcentage d'individus avec 25OHD mesuré par immunodosage à moins de 15 % (P15) ou 30 % (P30) de 25OHD mesuré par LC-MS/MS. Les valeurs de P15 et P30 pour les cinq immunodosages ont été comparées entre elles par le test de McNemar. Les analyses statistiques ont été effectuées à l'aide de Microsoft Excel 2007 (Microsoft Corporation, États-Unis) et du logiciel statistique MedCalc (version 13.3.3, Broekstraat, Mariakerke, Belgique).

Alors que tous les dosages immunologiques détectaient 25OHD2, les efficacités variaient. Seul DiaSorin a atteint une efficacité de détection de 100 % pour la détection de 25OHD3 (tableau 1). La plupart des immunodosages ont présenté moins de 3 % de réactivité croisée avec 3-epi 25OHD3 ; cependant, le système Roche était moins efficace pour séparer le 3-épi 25OHD3 du 25OHD3, présentant une réactivité croisée de 91 %. Fait intéressant, le système Roche avait une plage de mesure analytique relativement étroite (3 à 70 ng/mL). En revanche, les systèmes Roche et DiaSorin avaient une précision relativement meilleure que les autres plateformes, avec des CV et des inter-CV inférieurs à 5 %.

Parmi les échantillons totaux, la moyenne ± SD 25OHD était la suivante (Fig. 1) : 25,5 ± 12,0 ng/mL (LC-MS/MS), 24,6 ± 12,7 ng/mL (Abbott), 21,7 ± 11,1 ng/mL ( DiaSorin), 25,4 ± 9,9 ng/mL (IDS), 23,9 ± 12,5 ng/mL (Roche) et 39,5 ± 19,8 ng/mL (Siemens). Le test t apparié a montré que le résultat du système Siemens était significativement plus élevé que le résultat LC-MS/MS (P < 0,05), tandis que les résultats des immunoessais DiaSorin, Roche et Abbott étaient inférieurs aux résultats LC-MS/MS ( Tests T appariés, P < 0,05). La précision, telle qu'estimée par P15 et P30, a montré que les systèmes Abbott, DiaSorin, IDS et Roche ne différaient pas significativement l'un de l'autre (P15 : 43,67 %, 49,70 %, 45,18 % et 48,80 %, respectivement, test de McNemar, p > 0,05 ; P30 : 76,20 %, 81,93 %, 76,81 % et 75,60 %, respectivement, test de McNemar, p > 0,05), mais leurs valeurs de précision étaient significativement supérieures à celle du système Siemens (P15 : 14,76 % ; P30 : 27,11 %, test de McNemar test, p < 0,01).

Diagramme en boîte à moustaches montrant la distribution des résultats pour tous les tests testés dans un total de 332 échantillons de sérum.

Les cases centrales représentent la plage du 25e au 75e centile. Les lignes à l'intérieur des cases indiquent la valeur médiane et l'IC à 95 % de la valeur médiane pour chaque méthode testée. Les moustaches s'étendent de la valeur minimale à la valeur maximale, à l'exclusion des valeurs aberrantes. Une valeur aberrante est définie comme une valeur qui dépasse le quartile supérieur ou inférieur plus ou moins 1,5 fois l'intervalle interquartile.

La plupart des immunoessais (à l'exception de Siemens) ont montré une concordance diagnostique acceptable avec LC-MS/MS (Kappa > 0,6), tandis que Roche avait la meilleure valeur Kappa (tableau 2). Lorsqu'il n'y avait pas de 25OHD2 ou 3-epi 25OHD3 détectable, tous les dosages immunologiques, à l'exception de Siemens, étaient en excellent accord. Lorsque les hommes et les femmes ont été analysés séparément, les résultats du dosage immunologique 25OHD ont produit une tendance similaire à celle observée dans l'échantillon total (tableau supplémentaire 1).

De plus, compte tenu des différences entre les méthodes, nous avons utilisé des modèles de régression (calculés à partir des échantillons totaux) pour transférer les seuils des méthodes d'immunodosage. Après transfert, les seuils pour la définition de l'hypovitaminose D étaient de 20 (Abbott), 17 (DiaSorin), 21 (IDS), 19 (Roche) et 31 ng/mL (Siemens), respectivement. En utilisant ces seuils transférés, Siemens a montré la plus grande amélioration de la valeur Kappa (passée de 0,410 à 0,637) et la plupart des immunoessais ont montré un accord acceptable et amélioré avec LC-MS/MS (tableau 2).

Bien que le système DiaSorin était censé détecter le 25OHD avec une efficacité et une spécificité de 100 % pour le 25OHD3, le coefficient de corrélation a diminué, le biais a augmenté et la valeur Kappa a diminué de manière significative lorsque les échantillons contenaient du 25OHD2 ou du 3-épi 25OHD3 (Fig. 2). Les quatre autres immunoessais ont montré une tendance similaire (tableau 2). Le niveau de 25OHD2 était significativement corrélé au biais entre les méthodes d'immunodosage (pour Abbott, DiaSorin, IDS, Roche et Siemens : r = 0,848, 0,909, 0,834, 0,849 et 0,282, respectivement) et LC-MS/MS (Figure 2 supplémentaire). Et il a été démontré que lorsqu'il n'y avait pas de 25OHD2, le pourcentage de biais au niveau de la décision médicale de Roche était le plus faible, cependant, lorsque le 25OHD2 était présent, le pourcentage de biais au niveau de la décision médicale augmentait de manière significative (tableau supplémentaire 2).

Comparaison de DiaSorin et LC-MS/MS.

A – E sont des analyses de régression de Passing-Bablok pour 166 échantillons de sérum contenant uniquement du 25OHD3, 111 échantillons de sérum contenant à la fois du 25OHD3 et du 25OHD2, 31 échantillons de sérum contenant du 25OHD3 et les 332 échantillons de sérum, respectivement. F–J sont des tracés de Bland-Altman montrant le biais entre DiaSorin et LC-MS/MS pour 166 échantillons de sérum contenant uniquement du 25OHD3 ; 111 échantillons de sérum contenant à la fois du 25OHD3 et du 25OHD2 ; 31 échantillons de sérum contenant du 25OHD3 ; 24 échantillons contenant 25OHD3, 25OHD2 et 3-épi 25OHD3 ; et tous les 332 échantillons de sérum, respectivement.

Ensuite, pour clarifier si les tubes de prélèvement sanguin sous vide affectaient la précision des dosages immunologiques, nous avons analysé 10 échantillons après le prélèvement sanguin dans des tubes VACUETTE 4 ml sans additif et des tubes VACUETTE 4 ml avec gel et activateur de caillots et analysé tous les échantillons par le cinq immunoessais et LC-MS/MS. Les résultats ont été présentés sur la Fig. 3 et il a été montré que les échantillons prélevés dans des tubes VACUETTE de 4 ml avec un gel et un activateur de coagulation présentaient des valeurs apparemment plus élevées que les échantillons dans des tubes sans additifs (biais moyen (ET) : 12,7 (4,3) ng/mL , P < 0,01) en utilisant le système Siemens. 67 volontaires supplémentaires ont été recrutés et leur sérum a été collecté dans des tubes sans additif VACUETTE de 4 ml et pour les 77 échantillons au total collectés dans des tubes sans additif VACUETTE de 4 ml ont tous été analysés à la fois par le système Siemens et LC-MS/MS et le coefficient de corrélation entre les deux méthodes s'améliorait, le biais diminuait significativement et avec une pente proche de 1, indiquait un accord (Kappa = 0,68) (Fig. 4).

Le biais entre les résultats 25OHD dans les tubes VACUETTE de 4 ml avec gel et activateur de coagulation et dans les tubes VACUETTE de 4 ml sans additif de chaque méthode.

Axe X : nombre d'échantillons ; Axe Y : 25OHD donne des tubes VACUETTE de 4 mL avec gel et activateur de coagulation moins 25OHD donne des tubes VACUETTE de 4 mL sans additif.

Comparaison des résultats 25OHD pour Siemens et LC-MS/MS dans des tubes VACUETTE 4 ml avec gel et activateur de coagulation et des tubes VACUETTE 4 ml sans additif.

A et B sont la régression de Passing-Bablok et les tracés de Bland-Altman de 332 échantillons 25OHD analysés à l'aide de Siemens et LC-MS/MS pour le sang prélevé dans des tubes VACUETTE de 4 ml avec gel et activateur de caillot ; C et D sont la régression de Passing-Bablok et les tracés de Bland-Altman de 77 échantillons de 25OHD analysés à l'aide de Siemens et LC-MS/MS pour le sang prélevé dans des tubes sans additif VACUETTE de 4 ml.

Dans cette étude, nous avons examiné les différences dans la précision de cinq systèmes d'immunodosage différents pour l'analyse de la vitamine D et des analogues de la vitamine D dans des échantillons de sang de 332 personnes. Nos données ont démontré que la plupart des systèmes, à l'exception du système Siemens, présentaient une bonne acceptabilité et précision. De plus, avec le système Siemens, l'utilisation de tubes de prélèvement sanguin particuliers a considérablement affecté les résultats et nous avons résumé les effets des analogues de 25OHD et des tubes VACCUTTE sur les immunoessais dans le tableau supplémentaire 3. Ces données ont des implications dans le développement et l'application d'essais pour mesurer taux de vitamine D.

Ces dernières années, diverses organisations ont mené des études de normalisation de la vitamine D, telles que le programme de normalisation et de certification de la vitamine D des Centers for Disease Control and Prevention (CDC VDSCP) des États-Unis, le programme international d'évaluation externe de la qualité de la vitamine D (DEQAS) et le Vitamin D Standardization Program (VDSP) établi en 2010 par le National Institutes of Health (NIH) Office of Dietary Supplements, US Centers for Disease Control and Prevention, US National Institute of Standards and Technology (NIST) et le Belgium Laboratory for Analytical Chemistry (Gand, Belgique)19,20. Ces organisations ont également encouragé l'amélioration des produits à base de vitamine D pour obtenir une détection efficace de 25OHD2 et 25OHD3, ainsi que de 3-epi 25OHD3. Cependant, à notre connaissance, peu d'études se sont concentrées sur les effets du 25OHD2 et du 3-epi 25OHD3 sur les méthodes d'immunodosage. Par conséquent, notre étude actuelle a été la première à comparer les effets du 25OHD2 et du 3-epi 25OHD3 sur la précision et l'exactitude de divers dosages immunologiques.

Ces dernières années, les chercheurs ont comparé différentes méthodes de détection du 25OHD ; cependant, bien que des corrélations élevées entre les méthodes aient été trouvées dans certaines études, il n'a pas été possible de déterminer de manière cohérente la meilleure méthode. Farrell et al.8 ont rapporté que toutes les méthodes d'immunodosage testées étaient fortement corrélées avec LC-MS/MS, avec un coefficient de régression supérieur à 0,9, mais le système Roche a produit le coefficient de corrélation le plus faible (r = 0,679) ; en effet, le test utilisé dans l'étude précédente n'a pu détecter que le 25OHD3. Cependant, en mettant l'accent sur la vitamine D2, Roche a amélioré ses produits pour la détection de la 25OHD2 et de la 25OHD3 et nous avons utilisé le test amélioré dans notre expérience. Dans un rapport précédent21, il a été démontré que Siemens, DiaSorin et Roche produisaient des corrélations similaires et acceptables avec la LC-MS/MS, tandis que Koivula et al.22 ont rapporté que les systèmes Abbott, DiaSorin, IDS et Siemens produisaient de mauvais coefficients de régression et que seuls les systèmes Siemens et les systèmes IDS étaient en bon accord clinique avec LC-MS/MS. Cependant, Ajuria-Morentin et al.9 ont montré que le système Siemens produisait la corrélation la plus faible et le biais le plus important par rapport aux autres méthodes d'immunodosage, conformément à nos résultats.

Des différences substantielles entre les méthodes d'immunodosage peuvent être liées, en partie, à leurs différentes capacités de mesure de la 25OHD2 et de la 3-épi 25OHD3. Bien que tous les fabricants aient affirmé que leurs méthodes d'immunodosage pouvaient détecter le 25OHD2, DiaSorin affirmant que leur anticorps avait une efficacité molaire égale pour 25OHD2 et 25OHD3, tous les coefficients de régression ont diminué lorsque les échantillons contenaient du 25OHD2 et le biais entre les méthodes d'immunodosage et la LC-MS/MS était corrélé significativement avec le niveau de 25OHD2. Actuellement, les suppléments de vitamine D2 et de vitamine D3 sont utilisés en Chine et aux États-Unis, ce qui est problématique pour diagnostiquer une carence en vitamine D puisque nos résultats indiquent que la cohérence de la mesure de 25OHD2 par des immunodosages courants pourrait ne pas être satisfaisante. Ces résultats étaient en contradiction avec les résultats d'une étude de Le Goff et al., qui ont montré que seuls les systèmes Abbott et Siemens produisaient une réactivité insatisfaisante avec le 25OHD223. De plus, alors que tous les fabricants (à l'exception de Roche) ont affirmé que leurs tests avaient peu de réactivité croisée avec le 3-épi 25OHD3, nos résultats ont montré que pour tous les immunoessais testés, la corrélation avec LC-MS/MS diminuait significativement lorsque les échantillons contenaient du 3-épi 25OHD3 . Les niveaux de 3-epi 25OHD3 dans nos échantillons étaient relativement faibles par rapport au 25OHD total. D'une part, cela peut soutenir l'idée que le 3-epi 25OHD3 ne devrait pas affecter systématiquement les méthodes LC-MS/MS qui ne pourraient pas distinguer et séparer le 3-epi 25OHD3 du 25OHD324. En revanche, compte tenu des faibles taux de 3-épi 25OHD3 présents dans les échantillons, il a eu un effet relativement significatif sur les résultats de l'immunodosage. Ainsi, les faibles niveaux et la rareté du 3-épi 25OHD3 dans les échantillons de notre étude représentent une limitation importante de notre travail. Les études futures devraient examiner les effets de l'augmentation des concentrations de 3-épi 25OHD3 dans les échantillons.

Des études antérieures ont montré qu'il est nécessaire pour les laboratoires de développer des intervalles de référence et des protocoles spécifiques au site pour obtenir des résultats cohérents9. De plus, nos résultats soutiennent la proposition selon laquelle des intervalles de référence spécifiques au site sont nécessaires pour améliorer l'uniformité ; cependant, le degré d'amélioration dépendait de la plate-forme. Par exemple, les systèmes Siemens se sont améliorés davantage que les autres méthodes lorsque les valeurs seuils ont été transférées selon l'équation de régression.

Le seuil de carence en vitamine D est un sujet controversé25. L'IOM recommande que 12 ng/mL peuvent satisfaire les exigences nécessaires pour les adultes normaux26. En revanche, les endocrinologues ont passé en revue de nombreuses études sur la vitamine D et ont conclu que 20 ng/mL constituaient un meilleur seuil pour la définition d'une carence en vitamine D18. Selon nos résultats, la controverse peut être exacerbée par les différentes méthodes d'immunodosage utilisées dans diverses études. À l'avenir, il sera nécessaire de définir la carence en vitamine D à partir d'articles utilisant une méthode de référence, comme la LC-MS/MS. Cependant, compte tenu du biais important produit par Siemens, détecté dans la présente étude et par d'autres9, ce système Siemens particulier devrait produire des résultats variables en présence d'analogues de la vitamine D et est sensible à la valeur seuil utilisée. Siemens avait réussi le premier programme de normalisation hormonale pour la vitamine D organisé par le CDC américain en octobre 2014. Le programme de normalisation permet un biais moyen de 5 % comme critère d'acceptation et Siemens Healthcare Diagnostics, avec IDS, sont les seules méthodes d'immunoessai certifiées. Par conséquent, les résultats de notre étude et de l'étude d'Ajuria-Morentin et al.9 sont quelque peu déroutants dans ce contexte. Bien que Borai ait signalé que les tubes séparateurs de sérum BD n'affectaient pas les dosages immunologiques Abbott et DiaSorin dans la mesure de 25OHD327, les effets des tubes de prélèvement sanguin VACUETTE sur le dosage immunologique Siemens n'étaient pas clairs. Dans notre analyse, nous avons constaté que l'utilisation d'un tube VACUETTE avec gel et activateur de caillots, qui est couramment utilisé dans notre hôpital pour mesurer la 25OHD, entraînait des mesures significativement plus élevées que les échantillons prélevés dans des tubes sans additif à l'aide du système Siemens. Cependant, il est important de noter que la LC-MS/MS n'a pas produit de biais significatif en raison du type de tube utilisé. Les résultats 25OHD pour les échantillons de sang prélevés dans des tubes VACUETTE sans additifs ont montré d'excellentes performances par rapport à LC-MS/MS. Les raisons de ces observations ne sont pas comprises. Il est possible que l'activateur de caillot, le gel de séparation ou certains autres éléments du tube VACUETTE de 4 ml avec gel et activateur de caillot aient augmenté la réactivité croisée non spécifique entre les anticorps marqués par des particules magnétiques et l'ester d'acridinium, entraînant une augmentation des valeurs de chimiluminescence. Ces possibilités ne peuvent pas être totalement élucidées puisque les fabricants de tubes et Siemens maintiennent la confidentialité quant aux compositions spécifiques de leurs produits. Par conséquent, bien que les effets spécifiques ne soient pas connus, en particulier avec le système Siemens, il sera important de déterminer quels tubes de prélèvement sanguin sont appropriés pour une utilisation fiable. Nos résultats mettent en évidence la nécessité d'évaluer les effets des tubes de prélèvement sanguin lors du choix des immunodosages 25OHD. D'autres études sont nécessaires pour clarifier les mécanismes par lesquels le tube de prélèvement sanguin interfère avec la mesure de 25OHD à l'aide du système Siemens.

En résumé, nos résultats ont montré que la plupart des immunoessais automatisés présentaient une corrélation et un accord acceptables avec la LC-MS/MS lorsqu'il n'y avait pas de 25OHD2 ou 3-epi 25OHD3 détectable. Cependant, la présence de 25OHD2 ou de 3-épi 25OHD3 a eu des effets substantiels sur les résultats des méthodes d'immunodosage. Par conséquent, lors de la définition de la valeur seuil pour la carence en vitamine D, la différence entre les méthodes doit être prise en compte. De plus, lors de l'utilisation du système Siemens, il est essentiel d'utiliser des tubes de prélèvement sanguin sous vide appropriés pour mesurer la 25OHD dans les laboratoires cliniques ou pour les enquêtes épidémiologiques.

Comment citer cet article : Yu, S. et al. Les analogues de 25OHD et les tubes de prélèvement sanguin sous vide affectent considérablement la précision des dosages immunologiques automatisés. Sci. Rep. 5, 14636; doi : 10.1038/srep14636 (2015).

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Les auteurs tiennent à remercier les fabricants, dont Siemens, IDS, DiaSorin, Roche et Abbott, pour leur soutien en fournissant des réactifs et une assistance technique. Ce travail a été financé par le China National Clinical Key Subject Program et le National High Technology Research and Development Program of China (863 Program, 2014AA022304) et la National Natural Science Foundation of China (81201337, 81171665). Les bailleurs de fonds n'ont pas été associés à la réalisation de ce travail ni aux analyses réalisées et n'ont pas été impliqués dans la décision de publication.

Yu Songlin, Cheng Xinqi et Fang Huiling ont contribué à parts égales à ce travail.

Département de laboratoire clinique, Peking Union Medical College Hospital, Académie chinoise des sciences médicales, Pékin, 100730, Chine

Songlin Yu, Xinqi Cheng, Huiling Fang, Jianhua Han, Xuzhen Qin, Qian Cheng, Wei Su, Li'an Hou, Liangyu Xia et Ling Qiu

Département de laboratoire clinique, Hôpital Chine-Japon, Pékin, 100029, Chine

Ruiping Zhang

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QL a conçu la recherche; YS et FH ont contribué à l'acquisition, à l'analyse et à l'interprétation des données, ainsi qu'à la rédaction de l'article ; CX, ZR, HJ, QX, HL, SW, XL et CQ ont mené les recherches, recruté les sujets, analysé les échantillons et collecté les données. Tous les auteurs ont examiné le manuscrit.

Les auteurs déclarent une absence d'intérêts financiers en compétition.

Ce travail est sous licence internationale Creative Commons Attribution 4.0. Les images ou tout autre matériel tiers dans cet article sont inclus dans la licence Creative Commons de l'article, sauf indication contraire dans la ligne de crédit ; si le matériel n'est pas inclus dans la licence Creative Commons, les utilisateurs devront obtenir l'autorisation du titulaire de la licence pour reproduire le matériel. Pour voir une copie de cette licence, visitez http://creativecommons.org/licenses/by/4.0/

Réimpressions et autorisations

Yu, S., Cheng, X., Fang, H. et al. Les analogues de 25OHD et les tubes de prélèvement sanguin sous vide affectent considérablement la précision des dosages immunologiques automatisés. Sci Rep 5, 14636 (2015). https://doi.org/10.1038/srep14636

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Reçu : 02 juin 2015

Accepté : 02 septembre 2015

Publié : 30 septembre 2015

DOI : https://doi.org/10.1038/srep14636

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