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Mar 16, 2023

Mesure de l'expression antigénique des lignées cellulaires cancéreuses et des cellules tumorales circulantes

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 6051 (2023) Citer cet article

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Lors de l'évaluation des technologies d'enrichissement basées sur EpCAM pour les cellules tumorales circulantes (CTC), les lignées cellulaires utilisées doivent ressembler étroitement aux vrais CTC, ce qui signifie que l'expression EpCAM des CTC doit être connue, mais aussi l'expression EpCAM des lignées cellulaires dans différentes institutions et à différents moments. important. Comme le nombre de CTC dans le sang est faible, nous avons enrichi les CTC par l'épuisement des leucocytes à partir des produits de leucaphérèse diagnostique de 13 patients atteints d'un cancer de la prostate et mesuré l'expression d'EpCAM à l'aide de la cytométrie en flux quantitative. L'expression de l'antigène a été comparée entre plusieurs institutions en mesurant les cultures de chaque institution. L'efficacité de capture a également été mesurée pour l'une des lignées cellulaires utilisées. Les résultats montrent que les CTC dérivés de patients atteints d'un cancer de la prostate sensible à la castration ont une expression d'EpCAM variable mais relativement faible, avec une expression médiane par patient allant de 35 à 89 534 (moyenne de 24 993) molécules par cellule. Une grande variation dans l'expression de l'antigène de lignées cellulaires identiques cultivées dans différentes institutions a été trouvée, entraînant des récupérations lors de l'utilisation du système CellSearch allant de 12 à 83 % pour la même lignée cellulaire. Nous concluons que de grandes différences dans l'efficacité de capture peuvent se produire lors de l'utilisation de la même lignée cellulaire. Pour ressembler étroitement à de vrais CTC de patients atteints de cancer de la prostate sensibles à la castration, une lignée cellulaire avec une expression d'EpCAM relativement faible doit être utilisée, et son expression doit être surveillée fréquemment.

Les lignées cellulaires sont souvent utilisées pour comparer différentes méthodes ou optimiser les protocoles d'enrichissement et d'isolement des cellules tumorales circulantes (CTC). Les lignées cellulaires utilisées sont précisées dans certains articles ou revues où plusieurs technologies d'enrichissement sont comparées1,2,3,4. Cela permet une comparaison apparemment plus juste, car des caractéristiques telles que la taille, la déformabilité et l'expression de l'antigène peuvent différer considérablement entre les différentes lignées cellulaires. En particulier, cette dernière caractéristique est d'une grande importance lors de l'évaluation des technologies d'enrichissement à base d'antigènes.

Lors de l'utilisation d'un antigène de surface pour la capture sélective de cellules rares, un grand nombre d'interactions entre les surfaces revêtues et les cellules doivent être générées, tout en permettant également la rétention des cellules capturées. La méthode la plus utilisée pour cela est la capture immunomagnétique, où des billes (super-para-)magnétiques sont recouvertes d'un anticorps5. Pour la capture de CTC, dans la plupart des cas, l'antigène pertinent est la molécule d'adhérence des cellules épithéliales (EpCAM), un antigène qui est surexprimé dans la plupart des cancers d'origine épithéliale à la fois dans le tissu tumoral et dans les CTC6. Un exemple d'enrichissement immuno-magnétique est le système CellSearch, qui est la méthode la plus utilisée pour l'enrichissement en CTC7.

L'efficacité d'un tel enrichissement dépend largement du nombre d'antigènes présents à la surface cellulaire. Par conséquent, des lignées cellulaires avec des caractéristiques d'expression comparables doivent être utilisées lors de l'évaluation de ces technologies, imitant ainsi plus étroitement les vrais CTC. Ici, non seulement les caractéristiques utilisées pour la capture, mais également celles utilisées pour l'identification des CTC doivent être prises en compte. Le niveau d'expression de la cytokératine (CK) de la lignée cellulaire LNCaP souvent utilisée s'est par exemple avéré beaucoup plus élevé que celui des patients CTC8, ce qui rend leur identification irréaliste facile.

L'utilisation d'une lignée cellulaire avec une expression réaliste d'EpCAM est encore plus pertinente compte tenu de la découverte plus récente de l'existence d'une sous-population de CTC EpCAM-low ou même EpCAM-negative9,10,11,12,13. Plusieurs études ont déjà tenté d'augmenter la sensibilité de leurs méthodes de capture basées sur l'antigène, soit par l'utilisation d'antigènes supplémentaires14,15, soit en augmentant la force magnétique générée16,17,18, tandis que beaucoup se sont également concentrées sur des méthodes de capture complètement indépendantes d'EpCAM19. Ces méthodes sont toutes conçues pour capturer également des cellules exprimant une faible EpCAM ; même le système CellSearch utilise une approche brevetée spécialisée pour lier suffisamment de particules magnétiques aux CTC avec une faible expression d'EpCAM20.

Comme toute augmentation de la sensibilité se fera généralement au détriment de la spécificité, il serait avantageux de connaître la sensibilité nécessaire d'un tel système. Pour cela, le niveau d'expression antigénique des CTC dans les échantillons de patients doit être connu. Bien qu'il existe plusieurs études dans lesquelles l'expression d'EpCAM sur les CTC est évaluée21,22,23, à notre connaissance, seuls Rao et al. ont tenté de mesurer quantitativement l'expression d'EpCAM des CTC24, montrant de grandes différences entre l'expression d'EpCAM mesurée et plusieurs lignées cellulaires couramment utilisées. Dans ce travail, ils ont cependant fixé un seuil minimal d'expression d'EpCAM pour l'identification des CTC, excluant ainsi tout CTC EpCAM faible ou négatif. Cela signifie que la quantification de l'expression d'EpCAM sur la population totale de CTC est nécessaire pour pouvoir sélectionner efficacement les lignées cellulaires les plus représentatives, permettant une détermination réaliste de la sensibilité de tout test de capture basé sur EpCAM.

À cette fin, non seulement l'expression d'EpCAM dans les CTC, mais aussi celle de plusieurs lignées cellulaires devront être connues. Comme les caractéristiques cellulaires in vitro sont connues pour changer avec le temps25, non seulement le niveau actuel d'expression de l'antigène est important, mais également la variation est à noter. Cette variation pourrait probablement être minimisée par une large adhésion aux conditions de culture recommandées par l'ATCC. Dans la pratique cependant, des conditions culturelles dépendantes de l'institution sont souvent appliquées, ce qui peut conduire à de grandes différences entre les institutions. Pour tester cela, nous avons mesuré l'expression de plusieurs antigènes liés au cancer sur différentes lignées cellulaires lorsqu'elles sont cultivées dans nos propres conditions de culture standard, ainsi que sur des cellules qui ont été cultivées dans différentes institutions en utilisant leurs conditions de culture standard.

Comme les CTC dans les cancers non métastatiques, mais aussi métastatiques précoces, sont très rares26, la mesure de leurs caractéristiques est difficile. Un moyen d'atteindre un plus grand nombre de CTC consiste à utiliser la leucaphérèse27, qui permet l'interrogation de volumes sanguins plus importants. Par conséquent, dans le but de mesurer quantitativement leur niveau d'expression d'EpCAM, nous avons identifié des CTC du cancer de la prostate dans des échantillons de patients dérivés de la leucaphérèse à l'aide de marqueurs non-EpCAM. De plus, nous avons comparé leur expression d'EpCAM à celle de plusieurs lignées de cellules cancéreuses souvent utilisées.

Pour quantifier l'expression de différents antigènes, les cellules ont été colorées à l'aide d'anticorps monoclonaux couplés à la phycoérythrine (PE), après quoi le nombre de molécules de PE par cellule a été déterminé par cytométrie en flux quantitative. Bien que le nombre de molécules de PE ne soit pas exactement égal au nombre d'antigènes, nous traiterons dans ce travail le nombre de molécules de PE par cellule comme étant représentatif du nombre d'antigènes exprimés.

L'expression de l'antigène peut être mesurée soit directement, en utilisant un anticorps avec un fluorophore conjugué, soit via un anticorps non conjugué qui est ensuite marqué à l'aide d'un anticorps secondaire qui est conjugué à un fluorophore. La figure 1A montre que l'expression mesurée dans les cinq lignées cellulaires utilisées est plus faible lorsque l'antigène EpCAM est marqué à l'aide d'un anticorps directement conjugué par rapport à l'utilisation d'une coloration d'anticorps secondaire (Wilcoxon Signed Ranks Test, p <0,0001). Ceci est attendu, car lors de l'utilisation d'un anticorps secondaire polyclonal (par exemple, anti-souris-PE), plus d'un anticorps peut se lier à l'anticorps primaire résultant en un signal PE plus élevé. Ce phénomène concorde avec la différence d'expression quantifiée, qui diffère jusqu'à un facteur trois (moyenne 2,1, intervalle 0,7–3,6). Comme cette variation est observée dans toutes les lignées cellulaires, les différences d'expression relatives entre les lignées cellulaires restent similaires.

(A) Expression d'EpCAM de PC3 non fixé (N = 11), MCF7 (N = 4), SKBR3 (N = 4) et LNCaP (N = 11) mesurée soit à l'aide d'un anticorps directement conjugué, soit par coloration d'anticorps secondaire. (B) Expression EpCAM et Her2 des cellules LNCaP mesurées à l'aide de cellules fixes non fixées ou à 1 % de formaldéhyde (N = 3). (C) Expression de CK, Her2 et EpCAM mesurée de cellules LNCaP et PC3 non fixées, fixées par CellSave et fixées au formaldéhyde à 1 % après 24 h (N = 1).

Le temps entre le prélèvement de l'échantillon et la quantification de l'antigène dans un échantillon de patient est dans notre cas d'environ 24 h, ce qui signifie que l'expression de l'antigène doit être préservée pendant cette période. Dans de nombreux cas, cela se fait par fixation28, soit en utilisant un fixateur doux tel que CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) ou Cytochex (Streck), soit un fixateur plus dur tel que Transfix (Caltag Medsystems) ou 1 à 4 % de formaldéhyde (Merck) . L'effet d'une fixation sévère sur l'expression mesurée d'EpCAM et du récepteur 2 du facteur de croissance épidermique humain (Her2) a été déterminé dans quatre expériences indépendantes. Sur la Fig. 1B, on peut voir qu'une réduction significative (Wilcoxon Signed Ranks Test, p = 0,002) de l'expression de l'antigène mesurée est observée lors de la fixation cellulaire, avec une diminution moyenne de 72 % (plage de 52 à 93 %). Nous avons également testé l'expression de CK, Her2 et EpCAM après 24 h en utilisant des cellules non fixées stockées à 4 ° C, des cellules fixées CellSave et des cellules fixées au formaldéhyde à 1 %. Les résultats de la Fig. 1C montrent une expression préservée plus élevée d'EpCAM et de Her2 en utilisant CellSave par rapport aux cellules non fixées, tandis que la fixation du formaldéhyde a entraîné une forte diminution de la cytokératine intracellulaire, probablement causée par l'incapacité de l'agent de perméabilisation à perméabiliser suffisamment les cellules. membrane réticulée pour permettre le passage du PE-fluorophore relativement grand.

Nous avons déterminé l'expression d'EpCAM et Her2 tous les deux mois sur les cellules des lignées cellulaires PC3, PC3-9 et LNCaP sur une période de 20 mois (11 mesures) et sur les cellules des lignées cellulaires MCF7 et SKBR3 sur une période de 6 mois. (quatre mesures), Fig. 2. Ici, des différences statistiquement significatives (p < 0,02) dans l'expression de Her2 ont été trouvées entre toutes les combinaisons de lignées cellulaires, sauf lors de la comparaison de PC3 avec LNCaP (p = 0,17), PC3 avec PC3-9 (p = 1) ou LNCaP avec MCF7 (p = 1). L'expression d'EpCAM a montré une différence significative entre PC3 et PC3-9 par rapport à toutes les autres lignées cellulaires (p < 0,01). Aucune différence significative n'a été trouvée entre l'expression EpCAM de PC3 et PC3-9 (p = 0,07), LNCaP et SKBR3 (p = 0,20), MCF7 et LNCaP (p = 1) ou MCF7 et SKBR3 (p = 0,14), indiquant que pour ces lignées cellulaires, la variation de l'expression mesurée au sein de la même lignée cellulaire est dans cet ensemble de données trop importante pour distinguer de manière significative la différence d'expression entre ces lignées cellulaires.

Expression de (A) Her2 et (B) EpCAM dans les PC3, PC3-9, MCF7, SKBR3, LNCaP non fixés ainsi que dans le LNCaP fixé au formaldéhyde mesuré sur une période de 6 ou 20 mois. Les cases indiquent 25 à 75 centiles avec la médiane sous forme de ligne horizontale, les moustaches indiquent 10 à 90 centiles.

Pour évaluer si la variation observée au sein de chaque lignée cellulaire était causée par des changements dans l'expression de l'antigène ou par une variation expérimentale, nous avons également mesuré l'expression de Her2 et d'EpCAM sur un échantillon fixe de cellules LNCaP au cours de la même période de 6 mois, voir Fig. 2. L'expression médiane de Her2 des cellules LNCaP non fixées était de 46 523 molécules par cellule, mais réduite de 80% à 9133 antigènes dans l'échantillon fixe (p <0, 01), ce qui peut être attribué à l'effet de la fixation, comme le montre la figure 1B. Cependant, le coefficient de variation (CV) de l'expression de Her2 pour l'échantillon fixe n'était que légèrement supérieur à celui de l'échantillon non fixé (37 % contre 27 %). De même, l'expression médiane d'EpCAM des cellules LNCaP non fixées était de 728 738 antigènes par cellule et a diminué de 71 % à 213 430 antigènes par cellule pour les cellules LNCaP fixes (p < 0,01). Le CV de l'expression d'EpCAM dans l'échantillon fixe (51 %) était cependant similaire au CV de l'échantillon non fixé (54 %). Le CV de l'expression de Her2 de toutes les lignées cellulaires variait de 13 à 52 % et pour EpCAM de 30 à 75 %.

Compte tenu de la variation similaire observée dans les échantillons fixes par rapport aux échantillons non fixés, la cause principale de la variation mesurée de l'expression Her2 et EpCAM peut être attribuée aux variations de la mesure et non aux changements dans la lignée cellulaire réelle. Dans la Fig. S1 supplémentaire, les mêmes points de données sont affichés dans le temps, où un schéma similaire de changements d'expression peut également être observé pour plusieurs lignées cellulaires, ce qui est conforme au fait que les changements résultent principalement de variations inter-expérimentales. Il est cependant également clair à partir de ces données que les différences d'expression entre ces lignées cellulaires sont beaucoup plus importantes que la variabilité de mesure que nous avons trouvée, indiquant que bien qu'aucune quantification exacte ne puisse être obtenue, cette mesure peut être utilisée pour déterminer la plage d'expression de l'antigène.

D'après la figure 2, il devient clair qu'il existe une variation relativement importante dans l'expression mesurée entre différentes expériences menées à des intervalles d'environ deux mois. Pour déterminer dans quelle mesure cela a affecté la comparaison des expressions dans une seule expérience, nous avons déterminé la variation intra-expérimentale en mesurant l'expression d'EpCAM et Her2 sur les cellules PC3-9 et LNCaP en utilisant des échantillons en triple dans la même expérience, et la courte- variation inter-expérimentale à long terme en utilisant trois répétitions au cours de la même semaine. Pour cela, nous avons utilisé un lot de cellules fixées pour éviter la variation des conditions de culture. Les résultats sont présentés dans la Fig. S2 supplémentaire et montrent que pour les expériences en triple réalisées le même jour, la variation intra-expérimentale de l'antigène EpCAM hautement exprimé dans les cellules LNCaP est relativement faible avec un CV de 5, 6% mais augmente pour les antigènes avec une expression plus faible jusqu'à 144 % pour l'expression de Her2 dans PC3-9. De même, la variation inter-expérimentale est de 20% pour l'antigène EpCAM dans les cellules LNCaP et passe à 94% pour les antigènes Her2 dans les cellules PC3-9. Cela confirme qu'il est possible de déterminer la plage d'expression de l'antigène des cellules à faible expression de l'antigène, ainsi que des changements multiples dans les lignées cellulaires d'expression moyenne à élevée. Cependant, la quantification d'expressions d'antigène particulièrement faibles doit être considérée comme une confirmation de la plage d'expression d'antigène, et non comme une certaine détermination du niveau d'expression d'antigène exact des cellules.

De nombreuses institutions utilisent les mêmes lignées cellulaires, ce qui semble permettre la comparaison directe, par exemple, des technologies d'enrichissement immunomagnétique. Cependant, les institutions ont souvent des lignées cellulaires en culture pendant une période prolongée et, avec le temps, l'expression antigénique de ces cellules peut varier, soit en raison de conditions de culture différentes, soit simplement en raison d'un échantillonnage stochastique au passage. Pour mesurer les différences qui existent dans l'expression de plusieurs antigènes liés aux tumeurs, nous avons comparé leurs niveaux d'expression sur quatre lignées cellulaires d'au moins trois institutions ainsi que sur un flacon acheté directement auprès de l'American Type Culture Collection (ATCC). Pour cela, une aliquote des lignées cellulaires a été congelée dans de l'azote liquide sur chaque site et expédiée à l'Université de Twente. Le tableau supplémentaire S1 montre les détails de la culture pour chaque institution et le nombre de passages des cellules au moment de la mesure. Dans la plupart des cas, les établissements utilisent leurs propres méthodes de culture qui peuvent s'écarter des recommandations de l'ATCC. À l'Université de Twente, toutes les cultures de l'une des lignées cellulaires ont été décongelées et laissées se développer pendant environ 1 semaine. Ensuite, en une seule expérience, les expressions antigéniques de toutes les cultures de cette lignée cellulaire ont été déterminées. De cette manière, pour chaque lignée cellulaire, les expressions antigéniques de toutes les cultures disponibles ont été mesurées en une seule expérience.

La figure 3 montre les histogrammes du signal PE mesuré par cytométrie en flux. Dans la Fig. S3 supplémentaire, le nombre moyen correspondant d'antigènes est représenté pour chaque antigène et lignée cellulaire. Plusieurs différences dans l'expression de ces antigènes entre les cultures conservées dans différentes institutions peuvent être observées, telles que l'expression réduite de PSMA dans la lignée cellulaire LNCaP à l'Université de Twente ou la grande variation de l'expression de CK dans toutes les lignées cellulaires. Dans l'expression CK du SKBR3 et l'expression EpCAM des lignées cellulaires PC3 il apparaît que dans ces lignées cellulaires, la culture à l'ATCC dont sont issues toutes les autres, contient déjà deux sous-populations. Bien que l'Erasmus et l'Université de Twente utilisent les mêmes conditions de culture pour PC3 et qu'ils aient des nombres de passages similaires, la sous-population à expression élevée d'EpCAM semble avoir proliféré à l'Erasmus, tandis que la sous-population à faible expression est devenue dominante à l'Université de Twente.

L'expression d'EpCAM, Her2, PSMA et Cytokératine (CK) dans LNCaP, MCF7, PC3 et SKBR3 de l'ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR), Universitätsklinikum Düsseldorf (UKD) et Université de Twente ( UTAH). Les histogrammes du signal PE sont présentés tels que mesurés par cytométrie en flux.

Comme EpCAM est l'antigène le plus utilisé pour capturer les CTC, une variation dans l'expression de cet antigène devrait entraîner une différence dans l'efficacité de capture perçue des technologies d'enrichissement en CTC. Pour tester cela, nous avons dopé des nombres exacts de cellules PC3 de chacune des quatre institutions dans des échantillons de sang de donneurs sains. Nous avons ensuite traité ces échantillons à l'aide du système CellSearch et déterminé la récupération des cellules PC3 pour chaque établissement.

Sur la figure 4, l'expression d'EpCAM mesurée ainsi que la récupération CellSearch des cellules PC3 de chacune des quatre origines sont présentées. La récupération varie de 12% pour les cellules PC3 cultivées à l'Université de Twente jusqu'à 83% pour les cellules PC3 cultivées à l'Erasmus MC. La régression linéaire après transformation logarithmique de l'expression d'EpCAM a entraîné une régression de CSrec = − 101 + 30∙log (EpCAMexpr) avec un R2 de 0,97. Pour confirmer que les cellules sont bien des cellules PC3, une analyse à répétition en tandem courte (STR) a été effectuée sur PC3 (UT) et PC3 (EMC), confirmant que ces lignées cellulaires sont toutes des cellules PC3 (ATCC). Cette analyse a également confirmé que les cellules PC3-9 utilisées sont un sous-clone de la lignée cellulaire PC3, comme indiqué par leur profil STR.

Expression EpCAM de PC3 de l'ATCC, Erasmus MC (EMC), London Institute for Cancer Research (ICR) et Université de Twente (UT) avec la récupération CellSearch de chacune des lignées cellulaires. N = 3. La barre d'erreur indique la moyenne ± SD.

Nous avons évalué l'expression d'EpCAM des CTC de 13 patients atteints d'un cancer de la prostate métastatique subissant une leucaphérèse diagnostique (DLA). Les CTC ont été enrichis à partir d'échantillons dérivés de DLA par déplétion immunomagnétique des leucocytes avec une efficacité allant de 77,2 à 97,1 % (moyenne 90,3 %, ET 7,4 %). Un aperçu de l'échantillon d'entrée et de l'efficacité d'épuisement de tous les patients est présenté dans le tableau supplémentaire S2. Après épuisement, les échantillons ont été colorés avec CD45-, CD16-, biotine-FITC, Hoechst, Cytokeratin-APC, PSMA-PerCP/Cy5.5 et EpCAM-PE. Après lavage, les échantillons ont été remis en suspension dans 1 ml de PBS/1 % de BSA et exécutés sur un FACS Aria II (BD Biosciences) en utilisant un seuil sur Hoechst pour n'inclure que les événements nucléés. Un exemple de la mesure de cytométrie en flux est illustré à la Fig. S4 supplémentaire. Les événements ont été considérés comme CTC lorsqu'ils étaient négatifs pour CD45/CD16/biotine et positifs pour Hoechst, cytokératine et PSMA. Bien que l'ajout de la positivité du PSMA dans les critères d'identification des CTC augmente la certitude de leur identification correcte, certains CTC seront manqués par cette approche, car tous les CTC ne sont pas positifs pour le PSMA. L'expression d'EpCAM a ensuite été quantifiée sur les CTC identifiées. Pour voir si les intensités mesurées pouvaient être directement comparées à celles mesurées dans les mesures de lignées cellulaires, l'expression antigénique des cellules PC3 et LNCaP a été mesurée après dopage des cellules dans le matériau DLA et comparée à celle des mêmes cellules mesurées directement. Les résultats présentés dans la Fig. S5 supplémentaire indiquent que bien qu'il existe une différence dans le nombre mesuré d'antigènes par cellule, cette différence est bien inférieure aux différences observées entre les lignées cellulaires ainsi qu'entre les lignées cellulaires et les CTC de patients.

La figure 5A montre les niveaux d'expression d'EpCAM mesurés des CTC individuels trouvés chez 13 patients atteints d'un cancer de la prostate. Par patient, un nombre médian de 15 CTC a été mesuré (moyenne 148 CTC, plage de 2 à 1457 CTC). Comme l'expression d'EpCAM sur les CTC du patient 12 s'étend au-delà de l'échelle de la figure 5A, elle est également représentée séparément sur une échelle logarithmique sur la figure 5B. Les expressions d'EpCAM mesurées montrent une grande variation, à la fois au sein et entre les patients, avec la médiane par patient allant de 35 à 89 534 (moyenne 24 993, SD 28 521). Dans le tableau supplémentaire S2, la moyenne, la médiane et le CV de l'expression d'EpCAM mesurée de tous les patients sont indiqués. Ici également, la récupération relative des CTC par rapport à la quantité de CTC positifs au PSMA trouvée à l'aide du système CellSearch est indiquée.

Expression d'EpCAM des CTC trouvée dans les produits de leucaphérèse de 13 patients atteints d'un cancer de la prostate sensible à la castration. (A) Expression des CTC récupérés chez les patients P1-P13 sur une échelle linéaire montrant une grande variation à la fois entre les patients ainsi qu'au sein d'un patient. (B) Expression des CTC récupérés du patient P12 sur une échelle logarithmique. Les cases indiquent la médiane ± SD. En raison de la compensation appliquée pour l'autofluorescence, certaines cellules ont atteint une expression mesurée négative.

Pour voir comment l'expression d'EpCAM des CTC de patients est liée à celle des lignées cellulaires cancéreuses souvent utilisées, nous avons combiné l'expression d'EpCAM mesurée de tous les CTC de patients et l'avons comparée à l'expression d'EpCAM des cinq lignées cellulaires cancéreuses différentes, mesurée sur une période de 6 à 20 -mois, comme le montre la Fig. 6. Ici, chaque cercle indique l'expression d'EpCAM mesurée chez un patient distinct, tandis que la taille du cercle est liée au nombre de CTC mesurés. Les valeurs de p indiquées ont été déterminées à l'aide du test non paramétrique de Kolmogorov-Smirnov. On peut voir que les lignées cellulaires PC3 et PC3-9 cultivées à l'Université de Twente montrent une expression similaire à celle des CTC des patients, tandis que les trois autres lignées cellulaires montrent des expressions EpCAM beaucoup plus élevées, les rendant inaptes en tant que substitut CTC dans l'évaluation. de méthodes d'enrichissement ou d'identification à base d'EpCAM.

Expression d'EpCAM des CTC de 13 patients atteints d'un cancer de la prostate par rapport à l'expression mesurée dans cinq lignées cellulaires cultivées à l'Université de Twente. La position du cercle indique l'expression médiane par patient et la taille du cercle se rapporte au nombre de CTC mesurés pour chaque patient. Les cases indiquent 25 à 75 centiles avec la médiane sous forme de ligne horizontale, les moustaches indiquent 10 à 90 centiles. * indique une différence significative, les valeurs de p étant déterminées à l'aide du test non paramétrique de Kolmogorov-Smirnov.

Les lignées cellulaires de carcinome de la prostate PC3 et LNCaP et les lignées cellulaires de carcinome du sein MCF7 et SKBR3 ont été obtenues auprès de l'ATCC (Manassa, VA, USA). La lignée cellulaire PC3-924, un sous-clone de la lignée cellulaire PC3, a été aimablement fournie par Immunicon (Huntingdon Valley, PA, USA). PC3, PC3-9 et LNCaP ont été cultivés dans du RPMI1640 (Lonza), MCF7 et SKBR3 dans du DMEM (Lonza), tous additionnés de 10 % de FBS (Sigma) et de 1 % de Pen/Strep (Lonza). Les cellules ont été cultivées à 37 ° dans une atmosphère humide et trypsinisées lorsqu'elles ont atteint 70 à 80% de confluence en utilisant 0, 05% de trypsine-EDTA (Gibco, Life Technologies, Waltham, MA, USA).

Dans cette étude, nous avons inclus 13 patients pour la mesure de l'expression d'EpCAM sur les CTC. Tous ces patients viennent d'être diagnostiqués et n'ont pas encore reçu de traitement au moment du prélèvement de l'échantillon. Ces patients (âgés de 60 à 79 ans, médiane de 70 ans) sont tous des patients atteints d'un cancer de la prostate métastatique sensible à la castration qui ont été inclus dans l'étude PICTURES en cours sur la base de la présence de > 2 CTC dans un échantillon de sang de 7,5 mL. Dans l'une des expériences de dopage, du matériel provenant d'une patiente de l'étude SIBYLLA a été utilisé, dans laquelle des patientes atteintes d'un cancer du sein ayant terminé un traitement endocrinien adjuvant et ne présentant aucun signe clinique de récidive sont incluses.

La leucaphérèse a été réalisée à l'aide d'un Terumo Spectra Optia selon la procédure optimisée décrite par Mout et al.29. Des échantillons ont été prélevés conformément à la Déclaration d'Helsinki dans le cadre d'études approuvées par le comité d'éthique médicale du Centre médical Erasmus (étude PICTURES [MEC20-0422] et étude SIBYLLA [MEC20-0384]). Des échantillons de sang sains ont été prélevés sur des volontaires sains anonymisés dans un tube de prélèvement CellSave (Menarini-Silicon Biosystems) à l'Université de Twente. En accord avec la Déclaration d'Helsinki, le consentement éclairé a été obtenu de tous les volontaires et la procédure de collecte de sang utilisé a été approuvée par le Comité local d'éthique de la recherche médicale (METC Twente).

Les expressions ont été mesurées sur des cellules non fixées ou, le cas échéant, sur des cellules fixées avec CellSave ou du formaldéhyde à 1 %. Les expressions ont été déterminées en marquant l'antigène en utilisant soit un anticorps non conjugué, soit un anticorps conjugué à la PE pendant 30 min à 37°. Dans le cas d'un anticorps non conjugué, les cellules ont été lavées avec du PBS/1% BSA et colorées avec un anticorps secondaire anti-souris-PE (12-4010-87, Fisher Scientific) pendant 30 min à 37°. EpCAM a été mesuré à l'aide de l'anticorps anti-EpCAM VU1D9 non conjugué (cadeau aimable d'Immunicon, Huntingdon Valley, PA, USA) ou VU1D9 conjugué à PE (SAB4700425-100TST, Sigma). L'expression de Her2 a été mesurée à l'aide de Her2 non conjugué (aimable cadeau d'Immunicon, Huntingdon Valley, PA, USA). L'expression de PSMA a été mesurée à l'aide de PSMA-PE (342504, BioLegend) et la cytokératine a été mesurée à l'aide de CK11-PE (5075S, Cell Signaling Technologies). Les cellules colorées ont ensuite été lavées par centrifugation et remises en suspension dans du PBS/1 % BSA, après quoi l'intensité du signal PE de 10 000 cellules a été mesurée sur un cytomètre en flux (FACS Aria II, BD Biosciences). Le nombre de molécules de PE par cellule a été calculé à l'aide du kit de quantification PE Fluorescent (340495, BD Biosciences). Chaque tube de ce kit contient une pastille lyophilisée de billes conjuguées à quatre niveaux connus de PE. En utilisant l'intensité moyenne géométrique de ces quatre populations, nous avons créé une courbe d'étalonnage selon les instructions des fournisseurs. En utilisant cette courbe d'étalonnage, nous avons ensuite déterminé le nombre de molécules de PE sur les cellules mesurées avec l'utilisation de la valeur moyenne géométrique. Dans les expériences contenant des échantillons avec une coloration secondaire, l'intensité moyenne géométrique de PE d'un échantillon coloré en utilisant uniquement l'anticorps secondaire a été déduite des intensités mesurées pour corriger la coloration non spécifique. Dans les mesures utilisant des anticorps directement conjugués, le signal d'un échantillon non coloré a été utilisé pour cette correction.

Pour comparer différentes cultures des mêmes lignées cellulaires présentes dans différentes institutions, une aliquote de chaque lignée cellulaire a été congelée dans de l'azote liquide et envoyée à l'Université de Twente, tandis qu'un nouveau flacon de chaque lignée cellulaire a été commandé à l'ATCC. Dans le tableau supplémentaire S1, un aperçu des conditions de culture et des nombres de passages pour chaque lignée cellulaire et institution est présenté. Après leur arrivée, toutes les cellules ont été cultivées pendant environ deux semaines dans du RPMI1640 (LNCaP, PC3) ou du DMEM (MCF7, SKBR3) (Lonza) additionné de 10 % de FBS (Sigma) et de 1 % de Pen/Strep (Lonza), après quoi elles ont été recongelé dans de l'azote liquide à l'Université de Twente. Pour chaque lignée cellulaire, toutes les cultures ont été simultanément décongelées et cultivées pendant une à deux semaines dans les mêmes conditions, après quoi l'expression de tous les antigènes a été mesurée en une seule expérience.

Pour illustrer l'effet des différents niveaux d'expression de l'antigène sur la capture immunomagnétique, nous avons dopé un nombre connu de cellules PC3 obtenues auprès de différentes institutions dans 7,5 ml de sang de donneur sain. Pour cela, les cellules PC3 ont été colorées au Hoechst et amenées à une concentration d'environ 50 cellules par µL. Trois à cinq gouttelettes d'un ul ont été placées sur une lame de verre et imagées. À l'aide de ces images, le nombre de cellules dans chaque gouttelette a été compté manuellement après l'expérience. Les gouttelettes ont été rincées dans un échantillon de sang de 7,5 ml en utilisant 4 ml de tampon de dilution CellSearch, après quoi la lame de verre a été examinée pour les cellules restantes. L'enrichissement et la coloration ultérieurs ont été effectués à l'aide du système CellSearch (Menarini-Silicon Biosystems) avec le kit CTC standard. Le nombre de cellules PC3 trouvées après balayage et analyse avec le CellTracks Analyzer II (Menarini-Silicon Biosystems) a été utilisé pour calculer la récupération.

Pour évaluer l'expression d'EpCAM sur les CTC de patients cancéreux, nous avons enrichi les CTC à partir de matériel DLA de 13 patients atteints d'un cancer de la prostate par l'épuisement des leucocytes. Pour cela, une aliquote d'un échantillon DLA obtenu à l'Erasmus MC a été fixée avec le conservateur CellSave et expédiée pendant la nuit à l'Université de Twente. Des aliquotes de 200 millions de globules blancs (WBC) ont également été traitées à l'Erasmus MC à l'aide du système CellSearch. Ici, le PSMA a été ajouté en tant que marqueur supplémentaire, permettant la comparaison du nombre de DAPI + CK + PSMA + CD45-CTC trouvés après déplétion des leucocytes à celui trouvé en utilisant le système CellSearch. Pour l'épuisement effectué à l'Université de Twente, une aliquote d'échantillon composée en moyenne de 530 × 106 WBC (plage de 230 × 106 à 842 × 106 WBC) a été incubée avec CD45-Biotin (4 µg/mL, produit et couplé dans notre institution ), CD2-biotine (555325 BD Pharmingen), CD16-biotine (555405 BD Pharmingen) et CD19-biotine (555411 BD Pharmingen) pendant 15 min. Après l'ajout de 9 ml de tampon de caséine (phosphate de sodium 7 mM, chlorure de sodium 41,5 mM, azoture de sodium 0,1 %, EDTA 50 mM, BSA 0,5 %, sérum de souris 0,2 %, caséine 0,5 %, pH = 7,5), l'échantillon a été lavé par centrifugation à 800 G pendant 10 min et remise en suspension dans 6 ml de tampon caséine. À cela, des streptavidine-ferrofluides ont été ajoutés (18 µg/mL, BioMagnetic Solutions) et l'échantillon a été incubé pendant 15 min à température ambiante. La séparation des cellules liées a été réalisée en plaçant l'échantillon dans un aimant quadripolaire pendant 10 min. Par la suite, la fraction non liée a été éliminée à l'aide d'une pipette pasteur en verre reliée à une pompe à seringue (Harvard Apparatus). La pipette pasteur a été placée au centre du tube et l'aspiration a été réalisée à une vitesse de 2 mL/min. L'incubation magnétique et l'aspiration ont été répétées plusieurs fois si nécessaire pour atteindre un niveau d'épuisement suffisant. Pour l'identification des CTC, l'échantillon appauvri a été coloré à l'aide d'un cocktail de coloration composé de Hoechst (H3570, Invitrogen) pour colorer toutes les cellules, CK11-APC (1A-108-C100, Exbio), PSMA-PerCP/Cy5.5 (342512, BioLegend) et VU1D9-PE (SAB4700425-100TST, Sigma) pour l'identification positive des CTC et CD45-FITC (11-0459-42, eBioscience), CD16-FITC (302 006, BioLegend) et Streptavidin-FITC (S3762- 0,1 mg, Merck) pour colorer les globules blancs restants dans l'échantillon épuisé. Ici, la streptavidine-FITC est utilisée pour colorer toute biotine CD2, CD16, CD19 ou CD45 couplée aux cellules pendant la procédure d'épuisement, qui n'a pas été marquée avec une particule magnétique. Tous les réactifs de coloration ont été combinés dans un tampon contenant 0,05 % de saponine pour perméabiliser les cellules. Plusieurs contrôles ont été emportés pour permettre une compensation et un déclenchement corrects (LNCaP et PC3-9 colorés avec CK11, PSMA, VU1D9 et Hoechst respectivement ; DLA colorés avec CD45/CD16/Streptavidine et Hoechst respectivement ; échantillons non colorés de DLA, LNCaP et PC3 -9). Les cellules colorées ont ensuite été lavées et remises en suspension dans du PBS/1 % de BSA et l'intensité de la fluorescence a été mesurée sur un cytomètre en flux (FACS Aria II, BD Biosciences). Les CTC ont été identifiés comme des cellules CD45/CD16/Strep−, CK/PSMA+. Le signal EpCAM-PE a été quantifié à l'aide du kit de quantification fluorescente PE (340495, BD Biosciences), voir également la Fig. S4 supplémentaire. Comme la procédure d'épuisement, le grand fond de cellules indésirables ainsi que la plus grande complexité du mélange de coloration devraient influencer l'expression d'EpCAM mesurée, nous avons ajouté du DLA à partir de patients atteints de cancer de la prostate (étude PICTURES) ou du cancer du sein (étude SIBYLLA) avec environ 10 000 cellules PC3 ou LNCaP avant d'effectuer la procédure d'épuisement et de coloration, et comparé les expressions mesurées des cellules dopées à celles des cellules non dopées mesurées dans la même expérience.

La corrélation entre l'expression d'EpCAM et la récupération de CellSearch a été déterminée après transformation logarithmique de l'expression d'EpCAM.

Afin d'obtenir une distribution normale, les expressions antigéniques distribuées log-normalement ont été transformées en log et comparées en utilisant une ANOVA à une voie. Comme le test de Levene indiquait une variance homogène, nous avons effectué le test de Bonferroni pour déterminer les différences statistiques entre tous les groupes.

Lors de la comparaison de l'expression de l'antigène entre une seule paire, un test t à deux échantillons a été effectué sur des données transformées en log.

Dans les cas où des échantillons appariés provenant de différentes lignées cellulaires, antigènes ou méthodes de préparation ont été regroupés, les différences statistiques ont été déterminées à l'aide du test de rang signé de Wilcoxon non paramétrique.

Pour comparer l'expression d'EpCAM des CTC à celle de différentes lignées cellulaires, le test non paramétrique de Kolmogorov – Smirnov pour les échantillons non appariés a été utilisé. Toutes les analyses statistiques et de corrélation ont été effectuées à l'aide d'Origin 2019b (OriginLab Corporation, Northampton, MA, États-Unis) et un seuil de signification de 0,05 a été utilisé.

L'étude a été menée conformément à la Déclaration d'Helsinki et approuvée par les comités d'éthique des études PICTURES (MEC 20-0422) et SIBYLLA (MEC 20-0384).

Le consentement éclairé a été obtenu de tous les sujets impliqués dans l'étude.

Pour développer, comparer et tester efficacement des tests d'enrichissement basés sur l'antigène, l'expression de l'antigène du substitut CTC utilisé devra représenter de manière réaliste les vrais CTC. Ici, la caractéristique la plus importante est l'expression de l'antigène ciblé. Nous avons comparé l'expression de l'antigène EpCAM souvent ciblé dans les CTC dérivés de patients atteints d'un cancer de la prostate avec l'expression d'EpCAM de plusieurs lignées cellulaires bien connues à l'aide de la cytométrie en flux quantitative. Ici, il est important de réaliser que l'expression mesurée de tout antigène à l'aide de la cytométrie en flux quantitative dépendra d'une multitude de facteurs, dont nous n'avons montré qu'un nombre limité. L'un de ces facteurs est le rapport entre le nombre de molécules fluorescentes liées à une cellule et le nombre réel d'antigènes. Ce ratio est déterminé par l'efficacité de marquage de l'anticorps ainsi que le nombre de molécules fluorescentes par conjugué anticorps-fluorophore. Le premier dépend de plusieurs facteurs, dont le clone d'anticorps utilisé, la concentration d'anticorps, le temps d'incubation et la température d'incubation, mais un marquage complet n'est jamais atteint30. Ce dernier peut être vu dans la différence de coloration directe par rapport à l'anticorps secondaire (Fig. 1A).

Bien que les cellules non fixées soient le meilleur moyen de mesurer n'importe quelle caractéristique cellulaire, dans la pratique, les échantillons de patients sont souvent traités le lendemain. A cet égard, l'utilisation d'un fixateur doux tel que CellSave s'est avéré être un bon moyen de préserver l'expression de l'antigène, tandis qu'une fixation plus forte (formaldéhyde) semble rendre les antigènes moins accessibles à l'anticorps de détection. De plus, une fixation plus forte rend la perméabilisation avec 0,05 % de saponine inefficace, empêchant la coloration intracellulaire.

Comme les expressions d'EpCAM mesurées dans les CTC sont relativement faibles, la variation expérimentale entre ces mesures devrait également être similaire à celle observée pour PC3-9 (Fig. S2 supplémentaire). La plage d'expression mesurée est cependant pertinente, étant donné que la variation de L'expression d'EpCAM observée entre les patients est encore bien inférieure aux différences d'expression d'EpCAM observées entre le patient CTC et certaines des lignées cellulaires testées.

De plus, dans les mesures indépendantes prises à des intervalles de temps plus longs, la variation observée dans la mesure des cellules fixes indique qu'il existe également une variation expérimentale. Cependant, comme les CTC des patients ont été mesurés à 13 moments différents au cours de la même période pendant laquelle les expressions de la lignée cellulaire ont été mesurées, on s'attend à ce que l'effet de cette variation expérimentale sur les deux ensembles de mesures soit comparable.

Plusieurs différences dans les profils d'expression des mêmes lignées cellulaires cultivées dans différentes institutions sont trouvées, dans certains cas malgré un nombre de passages similaire et étant cultivées en utilisant le même milieu de culture. La prolifération de différents sous-types de cellules PC3 à l'Erasmus et à l'Université de Twente, par exemple, montre que l'utilisation du même milieu de culture n'est pas le seul facteur important. Il est probable que d'autres facteurs tels que le taux de passage, la densité d'ensemencement et le type de flacon de culture aient une influence.

Certains des CTC montrent une expression d'EpCAM mesurée inférieure à zéro. Cela est dû à la correction appliquée au signal de fond présent dans le cytomètre en flux. Comme nous appliquons une correction fixe pour chaque cellule basée sur l'intensité moyenne géométrique de l'échantillon de contrôle négatif, pour environ la moitié des cellules, cette correction sera supérieure à leur signal de fond réel, provoquant dans certains cas la quantité calculée de molécules de PE par cellule pour devenir négative. De même, environ la moitié des cellules sont moins corrigées que leur signal de fond réel. Pour garder la variation uniformément répartie, nous avons choisi de ne pas mettre ces valeurs négatives à zéro.

Comme on peut le voir sur la figure 6, parmi les lignées cellulaires testées, l'expression d'EpCAM des cellules PC3 et PC3-9 est la plus similaire à celle des CTC dérivés de patients atteints d'un cancer de la prostate. La seule autre étude qui, à notre connaissance, a tenté de mesurer quantitativement l'expression d'EpCAM sur les CTC est celle de Rao et al.24. Leurs résultats montrent une expression d'EpCAM mesurée plus élevée (49 708 antigènes par cellule) par rapport à nos découvertes. Ces expressions ne peuvent cependant pas être directement comparées car Rao et al. n'ont pas seulement utilisé des CTC de patients atteints d'un cancer de la prostate, mais ils ont également utilisé un seuil d'expression minimal d'EpCAM dans leur sélection de CTC, excluant de fait tout CTC négatif pour EpCAM. Cependant, il est intéressant de noter qu'ils ont également déterminé que l'expression d'EpCAM de la lignée cellulaire PC3-9 était appropriée en tant que représentant de CTC, ce qui est en partie dû à leur culture de cellules PC3-9 ayant une expression d'EpCAM plus élevée que la nôtre.

Lorsque l'on relie l'expression EpCAM des CTC à la récupération de CellSearch à l'aide de la régression linéaire illustrée à la Fig. 4, il devient évident que sur la seule base de leur expression EpCAM, la récupération attendue des CTC pour certains patients est de l'ordre de 1 à 5 %. Dans des études précédentes, nous avons détecté des CTC supplémentaires dans les déchets du système CellSearch13, mais pas à ce point. Nous pensons que la raison en est que la récupération de CellSearch ne dépend pas seulement de l'expression d'EpCAM, mais que d'autres caractéristiques telles que la taille sont également importantes dans la capture immunomagnétique des CTC. Pour être capturées, les cellules PC3 relativement grandes auront donc probablement besoin de plus d'expression d'EpCAM qu'un CTC de cancer de la prostate en moyenne plus petit.

À cet égard, nous nous attendions également à voir une corrélation entre l'expression d'EpCAM et la récupération relative des CTC en utilisant une approche d'épuisement par rapport à l'enrichissement CellSearch. Chez les 13 patients mesurés, nous n'avons cependant pas observé une telle relation (voir les données dans le tableau supplémentaire S2). Cela est probablement dû en partie à l'incertitude du niveau exact d'expression d'EpCAM chez ces patients, ainsi qu'à une variation de la perte de CTC au cours des procédures d'épuisement et de coloration. Un autre facteur qui pourrait entraîner la mesure de plus de CTC chez certains patients utilisant le cytomètre en flux est sa sensibilité plus élevée, ce qui fait que les cellules avec une expression égale de PSMA sont notées comme PSMA négatives dans CellSearch, alors qu'elles sont considérées comme positives dans la mesure de cytométrie en flux plus sensible.

Bien que ce ne soit clairement pas le seul facteur important, lors du choix d'une lignée cellulaire pour l'optimisation, il faut viser à utiliser une ou plusieurs lignées cellulaires dans la plage d'expression mesurée dans les vrais CTC. Comme on peut le voir sur la figure 3, cela ne signifie pas que les cellules PC3 achetées auprès de l'ATCC conviennent comme équivalent CTC à faible expression, car leur expression est au sommet de ce qui est mesuré dans les vrais CTC. Cette différence montre également la nécessité d'une quantification régulière de l'expression de l'antigène si des comparaisons utilisant des lignées cellulaires doivent être faites.

Dans ce travail, nous avons montré que la comparaison des méthodes d'enrichissement cellulaire à base d'antigène dans différentes institutions utilisant les mêmes lignées cellulaires peut entraîner de grandes différences d'efficacité de capture, car les lignées cellulaires cultivées dans différentes institutions montrent une grande variation dans l'expression de l'antigène. Idéalement, une lignée cellulaire avec une expression comparable aux vrais CTC est utilisée. Pour EpCAM, nous montrons une expression sur les CTC qui diffère entre les patients atteints d'un cancer de la prostate sensible à la castration, mais qui est bien inférieure à celle de nombreuses lignées cellulaires souvent utilisées pour évaluer les technologies d'enrichissement des CTC.

Les ensembles de données générés au cours de l'étude en cours sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable. Toutes les données de cytométrie en flux utilisées dans ce manuscrit sont disponibles au format de fichier standard .fcs. Les images utilisées pour le comptage des cellules dopées ainsi que les analyses CellSearch utilisées pour évaluer la récupération sont disponibles au format .tiff d'origine.

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Nous remercions l'Erasmus MC Rotterdam, le London Institute for Cancer Research et l'Universitäts Klinikum Düsseldorf pour nous avoir fourni plusieurs lignées cellulaires de cancer du sein et de la prostate. Nous remercions également l'Erasmus MC Rotterdam pour avoir fourni un échantillon aliquot provenant de l'étude SIBYLLA. Nous reconnaissons le GEDNAP Proficiency Tests Institute for Forensic Science (Münster) pour la réalisation de l'analyse STR.

Cette recherche a été financée en partie par le programme NWO/KWF PICTURES (17915).

Medical Cell Biophysics Group, Techmed Center, Faculté des sciences et technologies, Université de Twente, PO Box 217, 7500 AE, Enschede, Pays-Bas

Anouk Mentink, Leon WMM Terstappen & Michiel Stevens

Département d'oncologie médicale, Erasmus MC Cancer Institute, Erasmus University Medical Center, Rotterdam, Pays-Bas

Khrystany T. Isebia et Jaco Kraan

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Conceptualisation, LT ; conception, AM, MS, LT ; analyse, AM, MS ; acquisition, AM, KTI, JK, MS ; écriture, AM, MS ; révision et édition, AM, KTI, JK, LT, MS ; visualisation, AM, MS ; supervision, MS, LT

Correspondance à Michiel Stevens.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Mentink, A., Isebia, KT, Kraan, J. et al. Mesure de l'expression antigénique des lignées cellulaires cancéreuses et des cellules tumorales circulantes. Sci Rep 13, 6051 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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Reçu : 02 décembre 2022

Accepté : 08 avril 2023

Publié: 13 avril 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-33179-y

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