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Nov 13, 2023

La transplantation mitochondriale exogène améliore la survie et les résultats neurologiques après la réanimation d'un arrêt cardiaque

Volume de médecine BMC

BMC Medicine volume 21, Numéro d'article : 56 (2023) Citer cet article

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La transplantation mitochondriale (MTx) est une technologie émergente mais mal comprise avec le potentiel d'atténuer les lésions graves d'ischémie-reperfusion après un arrêt cardiaque (AC). Pour combler les lacunes critiques dans les connaissances actuelles, nous testons l'hypothèse selon laquelle MTx peut améliorer les résultats après la réanimation CA.

Cette étude comprend à la fois des études in vitro et in vivo. Nous avons d'abord examiné la migration des mitochondries exogènes dans la culture de cellules neurales primaires in vitro. Les mitochondries exogènes extraites des tissus cérébraux et musculaires des rats donneurs et les mitochondries endogènes des cellules neurales ont été marquées séparément avant la co-culture. Après une période de 24 h suivant la co-culture, le transfert mitochondrial a été observé en utilisant la microscopie. Les teneurs en adénosine triphosphate (ATP) in vitro ont été évaluées entre des mitochondries fraîchement isolées et congelées-décongelées afin de comparer leurs effets sur la survie. Notre étude principale était un modèle de rat in vivo de CA dans lequel les rats ont été soumis à 10 min de CA asphyxique suivi d'une réanimation. Au moment de la réussite de la réanimation, les rats ont été répartis au hasard dans l'un des trois groupes d'injections intraveineuses : véhicule, congelé-décongelé ou mitochondries viables fraîches. Au cours des 72 h post-AC, l'efficacité thérapeutique du MTx a été évaluée par comparaison des taux de survie. La persistance des mitochondries du donneur marquées dans les organes critiques des animaux receveurs 24 h après l'AC a été visualisée par microscopie.

Les mitochondries données ont été reprises avec succès dans des cellules neurales cultivées. Mitochondries exogènes transférées co-localisées avec des mitochondries endogènes à l'intérieur des cellules neurales. La teneur en ATP des mitochondries fraîches était environ quatre fois plus élevée que celle des mitochondries congelées-décongelées. Dans l'étude de survie in vivo, les mitochondries fonctionnelles fraîchement isolées, mais pas les mitochondries congelées-décongelées, ont augmenté de manière significative la survie à 72 h de 55 à 91 % (P = 0,048 par rapport au véhicule). Les effets bénéfiques sur la survie ont été associés à des améliorations de la récupération rapide des taux artériels de lactate et de glucose, de la microcirculation cérébrale, de l'œdème pulmonaire et de la fonction neurologique. Des mitochondries marquées ont été observées à l'intérieur des organes vitaux des rats survivants 24 h après l'AC.

La MTx effectuée immédiatement après la réanimation a amélioré la survie et la récupération neurologique chez les rats post-AC. Ces résultats fournissent une base pour de futures études visant à promouvoir le développement de MTx en tant que nouvelle stratégie thérapeutique pour sauver des vies actuellement perdues après l'AC.

Rapports d'examen par les pairs

La transplantation mitochondriale (MTx) est une technologie émergente qui a le potentiel d'améliorer la fonction des cellules endommagées par l'ischémie et la reperfusion (I/R). Lors d'un arrêt cardiaque (AC), une lésion ischémique épuise rapidement l'adénosine triphosphate cellulaire (ATP), génère des radicaux libres et dérégule le contrôle ionique du sodium et du calcium. Ces mécanismes déclenchent des cascades de signalisation supplémentaires qui peuvent s'aggraver lors de la reperfusion, entraînant un profond dysfonctionnement mitochondrial et la mort [1,2,3,4]. Heureusement, les mitochondries lésées sont capables d'auto-réparation et de protection cellulaire par la fission, la fusion, la mitophagie et le mécanisme récemment décrit de transfert mitochondrial intercellulaire [5, 6]. La découverte que les mitochondries peuvent migrer d'une cellule à l'autre suggère la possibilité de transplanter des mitochondries de donneurs sains dans des cellules avec des mitochondries blessées [7,8,9].

Un certain nombre d'études ont identifié des résultats améliorés après MTx dans les domaines des lésions cardiaques [10,11,12,13,14,15,16,17] et des accidents vasculaires cérébraux [6, 18]. Les mitochondries ont été injectées directement dans les tissus cibles ou délivrées par simple perfusion intraveineuse [18]. Cependant, la mesure dans laquelle les mitochondries sont absorbées par les neurones, les myocytes cardiaques et d'autres organes n'est pas connue. On ne sait pas combien de temps les mitochondries du donneur persistent dans les tissus en tant que mitochondries saines (respirantes) ou si elles fournissent simplement des particules mitochondriales biologiquement actives de courte durée. De plus, MTx n'a pas été étudié dans les lésions I/R après CA.

L'AC touche plus de 500 000 personnes aux États-Unis chaque année [19]. L'AC arrête toute circulation dans tout le corps, entraînant une ischémie du corps entier qui est mortelle si elle n'est pas traitée. Malgré les progrès de la réanimation et de la prise en charge post-arrêt des patients atteints d'AC, la mortalité dépasse 90 %, et parmi ceux qui survivent, beaucoup présentent des déficits neurologiques prolongés et des complications cardiovasculaires [20,21,22]. À l'heure actuelle, il existe peu de médicaments efficaces ou d'autres thérapies qui peuvent améliorer de manière significative ces mauvais résultats [23]. L'AC, ainsi que d'autres urgences ischémiques, reste un défi de santé publique important.

Notre étude teste l'hypothèse selon laquelle MTx peut améliorer les résultats après la réanimation d'une lésion ischémique grave telle qu'une AC. Nous nous concentrons sur trois questions importantes concernant MTx : (1) Les mitochondries allogéniques exogènes, extraites du cerveau ou du muscle, pénètrent-elles avec succès dans les cellules neurales en culture ? (2) L'infusion intraveineuse de mitochondries fraîches délivrées immédiatement après l'AC modifie-t-elle les taux de survie et d'autres indicateurs physiologiques de lésion I/R dans un modèle animal ? (3) Les mitochondries transplantées persistent-elles dans les tissus 24 h après l'AC ? Nous répondons à ces questions via une séquence d'études expérimentales qui fournissent une base pour évaluer plus avant le rôle du MTx dans l'atténuation des lésions multiviscérales et de la mortalité après réanimation de l'AC.

Pour déterminer si les mitochondries exogènes du donneur peuvent être absorbées par des neurones en culture, nous avons co-cultivé des mitochondries exogènes extraites du cerveau ou des tissus musculaires de rats donneurs avec des cultures de cellules neurales. Les mitochondries du donneur et les cultures de cellules neurales du receveur provenaient de rats mâles Sprague – Dawley (âgés de 12 semaines; Charles River Laboratories, Wilmington, MA, États-Unis). Les cellules neurales ont été isolées à l'aide du kit Adult Brain Dissociation (Miltenyi Biotec, Inc., Somerville, MA, USA). Les cellules ont été ensemencées à une densité de 1 × 105 cellules/cm2 sur des lamelles en verre recouvertes de poly-d-lysine (0,1 mg/mL). Les mitochondries endogènes (natives) des cellules ont été marquées séparément 24 h avant le transfert mitochondrial avec le colorant MitoTracker (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA, USA) conformément aux instructions du fabricant. En bref, les cellules ont été mises en suspension dans une solution de coloration préchauffée (37 ° C) contenant la sonde MitoTracker Green (300 nM) et incubées pendant 30 min dans un milieu standard dans des conditions de croissance appropriées. Après coloration, les cellules ont été lavées deux fois avec une solution saline tamponnée au phosphate (PBS) et remises en suspension dans un milieu frais.

Pour visualiser le transfert mitochondrial, des cellules neurales dans lesquelles les mitochondries endogènes étaient colorées en vert (voir ci-dessus) ont été co-cultivées avec des mitochondries exogènes données (rouge) dans un milieu de culture standard pendant 24 h, et les cellules ont été observées à l'aide d'un système d'imagerie confocale LSM 880 ( Carl Zeiss Meditec AG, Iéna, Allemagne).

Pour les expériences MTx dans la culture cellulaire, les tissus cérébraux dans un tampon d'isolement mitochondrial [210 mM de d-mannitol, 70 mM de saccharose, 5 mM d'HEPES, 1 mM d'EGTA et 0,5 % (p/v) d'albumine de sérum bovin sans acides gras (BSA ), pH ajusté à 7,2 avec KOH] ont été perturbés par 30 coups à 500 tr/min dans un homogénéisateur, après quoi l'homogénat a été centrifugé à 800 g pendant 10 min à 4 °C dans un rotor oscillant. Le surnageant a ensuite été centrifugé à 12 000 g pendant 10 min à 4 ° C pour créer un culot contenant les mitochondries. Après élimination du surnageant, le culot a été lavé deux fois avec un tampon d'isolement mitochondrial, et le culot a été remis en suspension dans une solution de coloration préchauffée (37 ° C) avec du PBS contenant la sonde MitoTracker Deep Red (300 nM) et incubé pendant 30 min. Après le retrait de la solution de coloration, les mitochondries marquées ont été lavées deux fois avec du PBS. Les mitochondries ont été quantifiées en déterminant la concentration en protéines à l'aide du test de Bradford (Pierce, Rockford, IL, USA) et conservées sur de la glace jusqu'à la transplantation. Les mitochondries (0,01 mg/mL, concentration finale) remises en suspension dans 500 μL de milieu frais préchauffé ont été immédiatement utilisées pour le transfert mitochondrial.

Des mitochondries dérivées de muscles de rats ont été utilisées à la fois pour des expériences MTx (A) en culture cellulaire et (B) en tant que mitochondries donneuses utilisées par infusion dans un rat in vivo, comme indiqué ci-dessous dans notre protocole de modèle CA. Les mitochondries ont été isolées à partir d'un morceau de 6 mm de tissu musculaire sain du grand pectoral d'un rat en utilisant une méthode d'isolement mitochondrial rapide, comme décrit précédemment [24]. Cette méthode utilisant un homogénéisateur automatisé et différentes filtrations développées pour une utilisation clinique lorsque la vitesse était essentielle car la procédure complète peut être effectuée en 30 minutes a été récemment rapportée par McCully et al. [8, 10, 24]. En bref, immédiatement après l'obtention du muscle à l'aide d'un poinçon de biopsie de 6 mm, le tissu a été haché dans un tampon homogénéisé froid [saccharose 300 mM, K-HEPES 10 mM et K-EGTA 1 mM (pH 7,2)] à 4 ° C et homogénéisé à l'aide d'un homogénéisateur automatisé (dissociateur gentleMACS; Miltenyi Biotec Inc., San Diego, CA, USA). L'homogénat a ensuite été soumis à une digestion pendant 10 min avec de la subtilisine A sur de la glace (protéase de Bacillus licheniformis ; Sigma-Aldrich, St. Louis, MO, USA), et l'homogénat digéré avec 0,49 % de BSA sans acides gras a été filtré à travers un série de filtres à mailles stériles jetables. Le filtrat a été centrifugé à 9000 g pendant 10 min à 4 °C, et le culot final a été remis en suspension dans 0,5 ml d'un tampon de respiration froide [saccharose 250 mM, KH2PO4 2 mM, MgCl2 10 mM, K-HEPES 20 mM (pH 7,2 ), K-EGTA 0,5 mM (pH 8,0)]. Le rendement en particules mitochondriales obtenues à l'aide d'un échantillon de tissu de biopsie de 6 mm a été rapporté comme étant d'environ 1 × 1010 mitochondries, ce qui a fourni suffisamment de mitochondries pour la perfusion, ainsi que l'assurance qualité et l'évaluation du contrôle qualité [8, 10, 24]. Des études antérieures ont constamment démontré la viabilité et la fonctionnalité des mitochondries isolées du muscle squelettique en utilisant cette méthode [10, 16, 24, 25]. Les mitochondries isolées ont été utilisées immédiatement pour une perfusion intraveineuse en tant que mitochondries fraîches du donneur ou ont été congelées et stockées à - 80 ° C pendant plus de 2 semaines jusqu'à leur utilisation ultérieure en tant que mitochondries congelées-décongelées.

La teneur en ATP a été déterminée dans (a) un tampon de respiration comme témoin négatif, (b) congelé-décongelé et (c) des mitochondries fraîchement isolées à l'aide d'un kit de dosage luminescent (ATPlite, PerkinElmer, MA) conformément aux instructions du fabricant. Un total de 10 µL de particules mitochondriales provenant des échantillons préparés ou du tampon de respiration ont été ajoutés à chaque puits d'une plaque à 96 puits à fond blanc et opaque. Après avoir mesuré la luminescence, la concentration d'ATP dans chaque puits a été calculée en utilisant la courbe standard obtenue à partir de la solution mère standard d'ATP.

Le potentiel de membrane mitochondriale (ΔψM) a été évalué par MitoProbe™ JC1 (5′,6,6′-tetrachloro-1,1′,3,3′-tetraethylbenzimidazolylcarbocyanine iodide) Assay Kit (Thermo Fisher Scientific, Waltham, MA) à l'aide d'un Cytomètre en flux BD FAC Symphony (BD Biosciences, San Jose, CA). JC1 présente une accumulation dépendante du potentiel (agrégats J) dans les mitochondries, indiquée par un décalage d'émission de fluorescence du vert (~ 529 nm) au rouge (~ 590 nm). Par conséquent, ΔψM peut être évalué par une augmentation des agrégats J de fluorescence rouge. Après isolement, la suspension mitochondriale dans 1 mL de tampon de respiration a été mélangée avec 10 μL de JC1 200 μM (concentration finale 2 μM) avec ou sans 1 μL de cyanure de carbonyle 50 mM 3-chlorophénylhydrazone (CCCP, concentration finale 50 μM). Le CCCP est un perturbateur potentiel de la membrane mitochondriale bien établi. Après incubation à 37°C pendant 30 min, la suspension a été centrifugée à 9000 g pendant 10 min à 4°C. Les culots ont été lavés une fois en ajoutant 1 ml de PBS et centrifugés. Les culots ont été remis en suspension dans 500 µL de tampon de respiration frais. Des échantillons non colorés ou des billes de référence de taille (Spherotech, Inc., Lake Forest, IL) ont été utilisés pour établir une taille mitochondriale appropriée et un réglage de tension. L'acquisition des événements JC1 Rouge positif a été réalisée sur 100 000 événements. Les pourcentages des agrégats J de fluorescence rouge JC1 ont été mesurés en tant que ΔψM dans les mitochondries fraîchement isolées, les mitochondries congelées-décongelées et un sous-groupe de mitochondries congelées-décongelées qui ont été traitées avec un perturbateur de potentiel membranaire CCCP comme contrôle ΔψM le plus bas. Des mitochondries non colorées ont été utilisées comme contrôle négatif. Les données ont été analysées avec le logiciel FlowJo (Tree Star, Ashland, OR, USA).

Des rats Sprague-Dawley mâles adultes (400 à 545 g, âgés de 12 à 16 semaines; Charles River Laboratories) ont été utilisés dans cette étude in vivo. Les animaux ont été logés dans une installation pour rongeurs sous un cycle lumière/obscurité de 12:12 h avec un accès ad libitum à la nourriture et à l'eau. Les rats ont été intubés avec un cathéter en plastique de calibre 14 (Surflo ; Terumo Medical Corporation, Somerset, NJ, USA) sous anesthésie avec 4 % d'isoflurane (Isosthesia ; Butler–Schein AHS, Dublin, OH, USA), ventilé mécaniquement et chirurgicalement préparé sous anesthésie (isoflurane 2%). Avant l'intervention chirurgicale, les sites chirurgicaux ont été nettoyés à la povidone iodée puis recouverts d'une couverture chirurgicale stérile, autocollante, transparente et traitée à la povidone. Toutes les procédures chirurgicales ont été réalisées à l'aide d'un équipement stérile et réalisées par les enquêteurs en aveugle des groupes expérimentaux. Le dioxyde de carbone de fin d'expiration a été maintenu à 40 ± 5 mmHg pendant l'expérience en ajustant la fréquence respiratoire (RR) et le volume courant (TV), ces paramètres étant ajustés dans la plage de 40/min à 50/min pour le RR et 3,5 à 5,0 mL de TV. Des microcathéters (PE-50 ; Becton Dickinson, Franklin Lakes, NJ, États-Unis) ont été insérés dans l'artère fémorale gauche et la veine fémorale gauche pour surveiller la pression artérielle et infuser des médicaments et des mitochondries du donneur, respectivement. De l'héparine (300 U) a été injectée dans la veine fémorale. La température oesophagienne a été maintenue à 37,0 ± 0,5 °C à l'aide d'un coussin chauffant thermostaté et d'une lampe chauffante pendant l'expérience. Les données de surveillance de la tension artérielle et de l'électrocardiogramme à l'aide d'une sonde à aiguille ont été enregistrées et analysées à l'aide d'un système d'acquisition de données basé sur un ordinateur personnel.

Toutes les études animales ont été réalisées à l'aide de protocoles approuvés par le Comité institutionnel de protection et d'utilisation des animaux de notre institution et conformément aux directives des National Institutes of Health. Les rats ont été soumis à l'AC et à la réanimation cardiopulmonaire, comme décrit précédemment [26, 27], avec des modifications mineures. En bref, avant l'induction de l'asphyxie, les rats ont été ventilés mécaniquement avec une fraction d'O2 inspiré (FIO2 ; 0,3) et l'anesthésie a été maintenue avec 2 % d'isoflurane pendant les interventions chirurgicales. L'asphyxie a été induite par le bromure de vécuronium intraveineux (2 mg/kg), suivi de l'arrêt du ventilateur et de l'arrêt de l'isoflurane. L'AC était définie comme une pression artérielle moyenne < 20 mmHg. 10 min après l'induction de l'asphyxie, la ventilation mécanique a été redémarrée à une FIO2 de 1,0 et des compressions thoraciques manuelles ont été effectuées à un rythme de 300/min par un seul investigateur en aveugle des groupes expérimentaux. 30 s après le début des compressions thoraciques, un bolus de 20 μg/kg d'épinéphrine a été administré et les compressions thoraciques ont été poursuivies jusqu'à la réussite de la réanimation, définie comme le retour du rythme supraventriculaire avec une pression artérielle moyenne > 60 mmHg pendant 10 s . Les rats ont été ventilés mécaniquement avec une FIO2 de 1,0 pendant les 10 premières minutes après la réanimation, après quoi la FIO2 a été réduite à 0,3, suivie d'une déconnexion du ventilateur mécanique et d'une extubation 2 h après l'AC. La pression artérielle, les enregistrements d'électrocardiogrammes et la température oesophagienne ont été surveillés pendant 2 h. Des échantillons de sang artériel pour les analyses des gaz sanguins et du lactate ont été obtenus au départ et 15 et 120 minutes après l'AC. Aucun agent inotrope supplémentaire n'a été administré. Après une période de récupération de 2 h, les animaux ont été sevrés du ventilateur, tous les cathéters vasculaires et tubes trachéaux ont été retirés et les plaies chirurgicales ont été suturées. Les rats ont ensuite été remis dans leurs cages avec de la nourriture et de l'eau facilement accessibles, et observés dans une installation pour rongeurs avec une température ambiante contrôlée de 22 ° C. De la buprénorphine XR (0,2 ml; 0,26 mg) a été injectée une fois par voie sous-cutanée pour soulager toute douleur due aux incisions chez tous les animaux pendant la période de récupération. Le temps de survie après CA a été enregistré jusqu'à 72 h.

Le score de la fonction neurologique (NFS) a été évalué par un chercheur en aveugle à 24, 48 et 72 h après l'AC en utilisant un système de notation neurofonctionnel précédemment rapporté [27]. Avec ce score, les animaux neurologiquement normaux recevraient un score de 500, tandis que les rats morts ou en état de mort cérébrale recevaient un score de 0 point.

Nous avons évalué la fraction d'éjection ventriculaire gauche (FEVG) au départ et 2 h après l'AC à l'aide d'une échocardiographie. L'échocardiographie transthoracique à thorax fermé a été réalisée par un seul chercheur en aveugle à l'aide d'une sonde de 12 à 4 MHz (transducteur à réseau sectoriel S12-4 ; Philips, Amsterdam, Pays-Bas), et toutes les mesures ont été moyennées sur trois cycles cardiaques.

Le rapport poids humide/sec du poumon (W/D) a été utilisé comme indice de formation d'œdème pulmonaire. Le lobe inférieur gauche a été retiré 72 h après l'AC, pesé immédiatement après le retrait (poids humide) et de nouveau après séchage dans une étuve à 37 °C pendant 7 jours (poids sec). Le Lung W/D a été calculé comme le rapport du poids humide au poids sec.

Les animaux soumis à l'AC ont été randomisés en blocs dans l'un des trois groupes d'interventions qui ont été administrées immédiatement après que les animaux ont réussi la réanimation : (a) perfusion du tampon respiratoire avec 0,49 % de BSA (groupe véhicule ; n = 11), (b) perfusion de mitochondries congelées-décongelées non fonctionnelles (groupe mito congelé-décongelé; n = 11), ou (c) infusion de mitochondries fraîches viables (groupe mito frais; n = 11). Le processus de congélation et de décongélation entraîne une perturbation généralisée de l'intégrité de la membrane externe mitochondriale et supprime l'activité de la chaîne de transport d'électrons par la perte de cytochrome c de l'espace inter-membranaire [28]. Pour cette raison, nous avons utilisé des mitochondries congelées-décongelées comme groupe de contrôle supplémentaire pour maintenir des quantités similaires de protéines mitochondriales, de lipides, d'ADN, d'ARN et d'autres macromolécules, telles qu'infusées dans les animaux traités avec des mitochondries fraîchement isolées. Ces mitochondries congelées-décongelées perturbées contiennent des quantités similaires de molécules biologiques mais n'ont ni viabilité ni compétence respiratoire.

L'isolement de l'ARN, la transcription inverse et l'analyse par PCR en temps réel ont été effectués sur des tissus cérébraux et spléniques récoltés 72 h après la réanimation post-CA et MTx conformément aux instructions du fabricant. L'ARN total a été extrait à l'aide du réactif TRIzol (Sigma-Aldrich, États-Unis) et transcrit à l'aide du mélange maître SuperScript IV VILO™ avec l'enzyme ezDNase (Thermo Fisher, États-Unis). La PCR en temps réel a été réalisée à l'aide du TaqMan Fast Advanced Master Mix (Thermo Fisher, USA) sur le système LightCycler 480 (Roche Diagnostics). The primers used are dynamin-related protein 1 (Drp1, Rn00586466_m1), mitochondrial fission 1 protein (Fis1, Rn01480911_m1), optic atrophy-1 (Opa1, Rn00592200_m1), Mitofusin-1 (Mfn-1, Rn00594496_m1), and Mitofusin-2 (Mfn-2, Rn00500120_m1).

Pour mesurer l'activité de la cytochrome c oxydase (COX) dans les tissus, le cerveau et la rate ont été obtenus à partir de rats opérés de manière fictive et de rats survivants 72 h après l'AC dans les groupes véhicule, congelé-décongelé ou mito frais. L'activité COX dans les homogénats de tissus a été mesurée à l'aide du kit Cytochrome C oxydase (Abcam, ab239711) conformément aux instructions du fabricant.

Dans un ensemble distinct d'expériences visant à déterminer les impacts de MTx sur la perfusion cérébrale pendant la phase aiguë post-CA, nous avons surveillé le débit sanguin cérébral relatif (rCBF) pendant les 2 premières heures après CA. L'imagerie de chatoiement laser du cerveau a été réalisée à l'aide du système RFLS III d'imageur de perfusion laser plein champ conformément aux instructions du fabricant (RWD Life Science Co., Ltd., Guangdong, Chine), comme décrit précédemment [29]. Une incision médiane du cuir chevelu a été faite pour exposer le crâne pour l'imagerie. Le crâne au-dessus de la surface corticale gauche a été aminci à l'aide d'un foret dentaire, en veillant à ce que la dure-mère reste intacte. L'imageur était positionné directement au-dessus de la surface du crâne aminci. L'acquisition d'image continue (constante de temps, 1 s ; temps d'exposition de la caméra, 5 ms ; intensité laser, 100 mA ; résolution, 2048 × 2048) a commencé à la ligne de base pré-CA et s'est poursuivie jusqu'à 2 h après CA. Les vaisseaux ont été reconnus en fonction de caractéristiques anatomiques, puis trois régions d'intérêt (ROI) ont été sélectionnées à la ligne de base pré-CA. Les ROI comprenaient la zone au-dessus de la veine cérébrale supérieure gauche et deux zones capillaires de la surface corticale gauche entre les veines cérébrales supérieures. Les intensités du signal de perfusion ont été calculées à chaque instant à l'aide du logiciel du système d'imagerie laser Speckle et normalisées par rapport à la ligne de base [29]. Les moyennes des valeurs de rCBF aux trois ROI ont été comparées entre les groupes.

Dans une série d'expériences distinctes, des rats soumis à l'AC ont été utilisés pour déterminer l'absorption et la persistance après 1 et 24 h de mitochondries marquées dans les organes vitaux à l'aide d'un microscope confocal. Les mitochondries fraîchement isolées ont été marquées avec MitoTracker Deep Red immédiatement après l'isolement, et le véhicule ou les mitochondries marquées ont été perfusés lors de la réanimation de CA. À 1 ou 24 h après l'AC, les animaux ont été euthanasiés et le cerveau, le cœur, les poumons, les reins, le foie et la rate ont été récoltés et fixés avec une solution de paraformaldéhyde à 4 %. Les coupes ont été montées avec un milieu de montage contenant du 4,6-diamidino-2-phénylindole (DAPI) (Vector Laboratories, Burlingame, CA, USA) et observées à l'aide d'un système d'imagerie confocale LSM 880 (Carl Zeiss Meditec AG, Jena, Allemagne).

Les données représentent la moyenne ± l'écart type. Les scores de la fonction neurologique ont été comparés à l'aide d'un test de Kruskal-Wallis, suivi du test de comparaison multiple de Dunn. Les données continues ont été analysées par une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec la correction de Šidák pour les comparaisons post hoc entre plusieurs groupes expérimentaux. Les données hémodynamiques, les changements de poids corporel, les données de laboratoire et de rCBF ont été examinées à l'aide d'un modèle à effets mixtes pour les analyses à mesures répétées, suivi d'une ANOVA avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc. Pour l'étude de survie in vivo, nous avons effectué une analyse de puissance pour calculer la taille de l'échantillon nécessaire pour obtenir une mesure fiable de l'effet. Comme le taux de survie moyen à 3 jours après l'AC était attendu à 40 % dans le groupe véhicule et à 85 % dans le groupe mitochondries fraîchement isolées, nous avons prévu que 11 rats par groupe étaient nécessaires dans chaque étude de survie (α = 0,05, β = 0,2 [puissance = 80 %], recto-verso). Toutes les données sont incluses (aucune valeur aberrante ou animal n'a été exclu de l'étude). L'analyse de Kaplan-Meier utilisant le test de Gehan-Breslow-Wilcoxon a été utilisée pour calculer les taux de survie entre les groupes. AP < 0,05 était considéré comme statistiquement significatif. GraphPad Prism (v.9.2.0; GraphPad Software Inc., La Jolla, CA, USA) a été utilisé pour toutes les analyses statistiques.

Après isolement des tissus, les mitochondries exogènes du donneur ont été colorées avec MitoTracker Deep Red puis co-cultivées avec des cellules neurales, dont les mitochondries endogènes sont colorées avec MitoTracker Green. Des mitochondries cérébrales exogènes ont été reprises dans des cellules neurales par simple co-culture pendant 24 h (Fig. 1A). Mitochondries exogènes transférées (rouges) co-localisées avec des mitochondries endogènes (vertes) des cellules neurales, indiquant le mouvement des mitochondries exogènes à l'intérieur des cellules, comme en témoigne la coloration jaune fusionnée. De plus, nous avons observé un transfert mitochondrial exogène dérivé du muscle dans les cellules neurales (Fig. 1B). Ces résultats suggèrent que les mitochondries exogènes dérivées du cerveau et des muscles peuvent être efficacement transférées dans les cellules neurales.

Transfert de mitochondries exogènes dérivées du cerveau et des muscles dans des cultures de cellules neurales. Images représentatives de mitochondries exogènes colorées avec MitoTracker Deep Red et co-cultivées avec des cellules cérébrales, dont les mitochondries endogènes ont été colorées avec MitoTracker Green. Les mitochondries exogènes (rouges) ont été extraites A du cerveau ou B du muscle pectoral du rat donneur. La barre d'échelle indique 20 µm

Notre découverte la plus significative a été une augmentation spectaculaire de la survie neurologiquement intacte lorsque les rats post-AC ont été traités avec des mitochondries fraîchement isolées infusées par rapport aux deux conditions de contrôle. Les trois groupes de 11 animaux étaient chacun constitués des éléments suivants : (1) un simple véhicule de traitement comme contrôle négatif (tampon de respiration avec 0,49 % de BSA), (2) un contrôle négatif supplémentaire de mitochondries non fonctionnelles congelées-décongelées, et (3) notre groupe d'intervention MTx qui a reçu des mitochondries de donneurs fraîchement isolées. La figure 2A illustre que les mitochondries fraîchement isolées sont fonctionnelles par rapport aux mitochondries congelées-décongelées. Comme prévu, la teneur en ATP des mitochondries fraîchement isolées était environ quatre fois plus élevée que celle des mitochondries congelées et décongelées. Les analyses de cytométrie en flux ont confirmé que le ΔψM était nettement plus élevé dans le groupe mito frais par rapport au groupe mito congelé-décongelé (65, 60 ± 18, 50, 19, 06 ± 6, 28, P = 0, 047). CCCP n'a pas modifié le ΔψM dans le groupe mito congelé-décongelé (Fig. 2B). Ces observations suggèrent que les mitochondries fraîchement isolées ont un ΔψM nettement plus élevé que les mitochondries congelées-décongelées et que le processus congelé-décongelé peut être suffisant pour perturber le potentiel membranaire.

Les mitochondries fraîchement isolées sont plus fonctionnelles que les mitochondries congelées-décongelées. A Teneur en ATP mitochondriale dans le véhicule, les mitochondries congelées-décongelées et les mitochondries fraîches immédiatement après l'isolement des mitochondries. Une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc a été utilisée. n = 3–4 par groupe. B L'analyse par cytométrie en flux du potentiel de membrane mitochondriale des mitochondries isolées colorées avec JC-1 a vérifié que le pourcentage d'agrégats J était nettement plus élevé dans le groupe mito frais que dans le groupe mito congelé-décongelé. Le cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone (CCCP) n'a pas modifié le ΔψM dans le groupe mito congelé-décongelé. L'ANOVA unidirectionnelle avec la correction de Šidák pour les comparaisons post hoc a été utilisée. n = 4 par groupe

Dans un modèle in vivo de rat de CA, aucune différence n'a été observée dans les caractéristiques de base et les paramètres hémodynamiques périopératoires entre les groupes véhicule, congelé-décongelé et mito frais (tableau 1). Les taux de survie à 72 h dans les groupes véhicule et mito congelé-décongelé étaient de 54,5 % (6 rats sur 11 pour les deux groupes). En revanche, les animaux recevant des injections intraveineuses de mitochondries fraîches ont démontré une amélioration significative des taux de survie à 72 h de 90,9 % (10 rats sur 11 ; P = 0,048 par rapport au véhicule ; P = 0,038 par rapport au mito congelé-décongelé) (Fig. 3A) . De plus, sous réserve de survie, le NFS était significativement plus élevé dans le groupe mito frais que dans le groupe véhicule à 72 h après l'AC (P = 0, 047) (Fig. 3B). Nous avons également évalué les mesures de maintien du poids chez les rats survivants 72 h après la réanimation. Les poids corporels du groupe mito frais étaient significativement plus élevés que ceux du groupe mito congelé-décongelé 72 h après l'AC (Fig. 3C).

La transplantation mitochondriale à l'aide de mitochondries fraîchement isolées améliore la fonction neurologique et la survie à 72 h après un arrêt cardiaque et une réanimation. A Taux de survie au cours des 72 premières heures après un arrêt cardiaque (AC) et une réanimation. n = 11 par groupe. *P = 0,048 par rapport au groupe véhicule ; #P = 0,038 par rapport au groupe mito congelé-décongelé. L'analyse de Kaplan-Meier utilisant le test de Gehan-Breslow-Wilcoxon a été utilisée. B Scores fonctionnels neurologiques (NFS) à 72 h après l'AC chez les animaux survivants dans le véhicule, les mitochondries congelées-décongelées ou les groupes de mitochondries fraîchement isolées. Un score de 0 indique une mort cérébrale ou des rats morts. Les animaux morts ont été exclus des analyses. Le test de Kruskal-Wallis suivi du test de comparaison multiple de Dunn a été utilisé. C Changements quotidiens du poids corporel chez les animaux post-AC traités avec le véhicule, les mitochondries congelées-décongelées ou les mitochondries fraîches. Un modèle à effets mixtes pour les analyses à mesures répétées, suivi d'une ANOVA unidirectionnelle avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. *P = 0,044 par rapport au groupe véhicule. Les données représentent la moyenne ± l'écart type

La figure 4A montre la réduction significative des niveaux de lactate artériel observés chez les rats post-CA dans les 15 minutes suivant la réanimation dans le groupe mito frais par rapport aux niveaux de lactate plus élevés observés dans les groupes véhicule et congelé-décongelé. Nous avons également évalué l'œdème pulmonaire à 72 h après la réanimation en mesurant la teneur en eau du poumon, qui était nettement inférieure dans le groupe mito frais (W/D, 4,23 ± 0,85) par rapport à celle du véhicule (5,70 ± 0,75, P = 0,027) et groupes congelés-décongelés (6,21 ± 1,40, P = 0,003) (Fig. 4B). L'échocardiographie a confirmé l'absence de différences significatives dans les paramètres hémodynamiques précoces. Comme prévu, l'AC a entraîné une réduction de la FEVG 2 h après la réanimation dans tous les groupes (Fig. 4C). Cependant, nous n'avons pas été en mesure d'identifier des différences significatives entre les groupes MTx et témoin pour les paramètres hémodynamiques de la pression artérielle, de la fréquence cardiaque et de la fraction d'éjection ventriculaire gauche au cours des 2 premières heures de surveillance après la réanimation (Fig. 4C, D). La surveillance a été interrompue après ce moment ; ainsi, aucun changement possible au-delà de ce point n'a pu être observé. De plus, nous avons observé un pH artériel plus élevé à 15 min et une pression partielle artérielle de dioxyde de carbone plus faible dans le groupe mito frais par rapport aux groupes véhicule et congelé-décongelé. Les niveaux de glucose, qui sont généralement assez élevés chez les animaux immédiatement après l'AC, étaient plus faibles après 15 min chez les animaux soumis à MTx par rapport aux autres groupes. Notamment, ces niveaux sont tous revenus à la ligne de base à 120 min (Fig. 5). Les groupes ne différaient pas en termes de pression partielle d'oxygène, de saturation en oxygène, d'excès de base, d'hématocrite ou de taux d'électrolytes sanguins (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S1).

La transplantation mitochondriale améliore la normalisation précoce du lactate et atténue les lésions pulmonaires après un arrêt cardiaque et une réanimation. A Niveaux de lactate artériel au départ avant l'arrêt et 15 et 120 minutes après la réanimation. n = 11 par groupe. Un modèle à effets mixtes pour les analyses à mesures répétées, suivi d'une analyse de variance unidirectionnelle (ANOVA) avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. B L'œdème pulmonaire induit par un arrêt cardiaque à 72 h après la réanimation a été diminué en délivrant des mitochondries fraîchement isolées. C Fraction d'éjection ventriculaire gauche au départ avant l'arrêt et 2 h après la réanimation chez les rats après l'arrêt traités avec un véhicule, des mitochondries congelées-décongelées (congelées-décongelées-mito) ou des mitochondries fraîchement isolées (frais-mito). Un modèle à effets mixtes pour l'analyse à mesures répétées, suivi d'une ANOVA avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. D Modifications de la pression artérielle moyenne (PAM). Un modèle à effets mixtes pour l'analyse à mesures répétées, suivi d'une ANOVA avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. Les données représentent la moyenne ± l'écart type

La transplantation mitochondriale normalise les paramètres métaboliques tôt après l'arrêt cardiaque et la réanimation. Artériel A pH, B pression partielle de dioxyde de carbone (PaCO2) et taux de glucose C à la ligne de base pré-CA et à 15 min et 2 h après la réanimation entre les groupes. *P < 0,05 ; mito frais par rapport au groupe véhicule, #P < 0,05 ; groupe mito frais vs mito congelé-décongelé. n = 11 par groupe. Un modèle à effets mixtes pour l'analyse à mesures répétées, suivi d'une ANOVA avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. Les données représentent la moyenne ± l'écart type

Pour mieux caractériser le mécanisme des effets bénéfiques de l'injection mitochondriale fraîche, nous avons mesuré les changements dans l'expression génique des marqueurs de la fission mitochondriale (Drp1, Fis1) et de la fusion mitochondriale (Opa1, Mfn1, Mfn2) dans des homogénats tissulaires du cerveau et de la rate de rats opérés de manière fictive ou rats survivants 72 h après l'AC dans le groupe véhicule, congelé-décongelé ou mito frais. Les résultats sont présentés sur la figure 6. Dans le cerveau, les mitochondries fraîches ont nettement atténué les expressions géniques de toutes les protéines de fusion par rapport aux mitochondries congelées-décongelées. MTx avec des mitochondries fraîches a nettement diminué les expressions géniques de Mfn1 et Mfn2 par rapport au groupe véhicule, tandis que les mitochondries congelées-décongelées n'ont pas affecté les expressions géniques des protéines de fission ou de fusion. Les groupes ne différaient pas en termes de gènes de fission mitochondriale. Dans la rate, les mitochondries fraîches ont nettement atténué l'expression génique d'Opa1 par rapport aux mitochondries congelées-décongelées. De plus, l'expression du gène Drp1 dans la rate était nettement plus élevée dans le groupe mito frais que dans le groupe véhicule.

Modifications de l'expression génique dans le cerveau et la rate chez des rats survivants 72 h après un arrêt cardiaque et une réanimation avec ou sans transplantation mitochondriale. Expression génique de molécules liées aux protéines de fission mitochondriales (dynamin-related protein 1 [Drp1], mitochondrial fission 1 protein [Fis1]) dans le cerveau A et la rate B et aux protéines de fusion mitochondriales (optic atrophy-1 [Opa1], Mitofusin-1 [Mfn-1], Mitofusine-2 [Mfn-2]) dans le cerveau C et la rate D. L'ANOVA avec la correction de Sidak pour les comparaisons post hoc a été utilisée. n = 6, 6 et 10 pour les groupes véhicule, mito congelé-décongelé et mito frais, respectivement. Les données représentent la moyenne ± l'écart type

Nous avons également mesuré l'activité COX dans les homogénats tissulaires du cerveau et de la rate de rats opérés de manière fictive ou de rats survivants 72 h après l'AC dans le groupe véhicule, congelé-décongelé ou mito frais. Les résultats sont présentés dans le fichier supplémentaire 1 : Fig. S2. Le dosage enzymatique colorimétrique a montré que les groupes ne différaient pas en termes d'activité COX à la fois dans le cerveau et la rate. L'activité COX dans le groupe véhicule n'a pas changé par rapport à celles du groupe opération fictive, suggérant la récupération de l'activité COX dans les homogénats de tissus 72 h après la réanimation CA chez les animaux survivants.

Pour mieux identifier l'effet du MTx sur la fonction neurologique, nous avons mené une série distincte d'études animales, mesurant l'impact du MTx sur le flux sanguin cérébral pendant 2 h après l'AC. Nous avons mesuré le rCBF, où relatif fait référence à la ligne de base, dans trois ROI sur la surface corticale du cerveau. Nous avons utilisé un système d'imagerie laser speckle, comparant le rCBF mesuré minute par minute pendant l'AC jusqu'à 2 h après l'AC. La figure 7A montre des images représentatives des trois retours sur investissement des animaux dans chacun des trois groupes au départ et 2 h après CA. La figure 7B compare la récupération de la perfusion cérébrale dans les trois groupes (n = 6 dans chaque groupe). Les rats post-AC qui ont reçu MTx avaient amélioré le rCBF à 2 h par rapport à l'un ou l'autre des groupes témoins : 107,7 % ± 5,6 % dans le groupe mito frais par rapport à 77,5 % ± 4,5 % dans le groupe véhicule (P < 0,0001) et 81,3 % ± 15,9 % dans le groupe mito congelé-décongelé (P = 0,024).

La transplantation mitochondriale améliore la perfusion cérébrale tôt après un arrêt cardiaque et une réanimation. A Photographies représentatives de l'imagerie de contraste de chatoiement laser à la ligne de base pré-CA et à 2 h après CA en trois groupes. B Modifications du débit sanguin cérébral relatif moyen (rCBF) des ROI chez les rats post-AC traités avec un véhicule, des mitochondries congelées-décongelées (gelées-décongelées-mito) ou des mitochondries fraîchement isolées (frais-mito). Un modèle à effets mixtes pour l'analyse à mesures répétées, suivi d'une ANOVA avec correction de Šidák pour les comparaisons post hoc, a été utilisé. n = 6 par groupe. Les données représentent la moyenne ± l'écart type

Dans une série supplémentaire d'études animales, nous avons déterminé la persistance visuelle de mitochondries de donneurs fraîchement isolées étiquetées dans les organes et tissus critiques d'animaux AC receveurs par microscopie. L'imagerie par fluorescence confocale des mitochondries marquées avec MitoTracker Deep Red a confirmé qu'à 1 et 24 heures après l'injection après l'AC, des mitochondries transplantées ont été observées dans le cerveau, les reins et la rate (Fig. 8). Nous n'avons pas observé de persistance similaire des mitochondries marquées après 24 h dans le cœur, le foie ou les poumons (Fichier supplémentaire 1 : Fig. S3).

L'imagerie de fluorescence confocale révèle la persistance des mitochondries du donneur dans les organes à 1 et 24 h après l'arrêt cardiaque et la réanimation. Des mitochondries transplantées (rouges) ont été observées dans le cerveau, les reins et la rate 1 et 24 h après l'arrêt cardiaque. Les pointes de flèche indiquent les particules mitochondriales données étiquetées à l'aide du colorant MitoTracker Deep Red avant l'injection. Les noyaux cellulaires ont été contre-colorés avec du DAPI (bleu). La barre d'échelle indique 20 µm

Dans cet article, nous rapportons le potentiel de MTx pour atténuer les dommages causés par les lésions ischémiques graves observées dans CA. Nous avons constaté que MTx augmentait considérablement la survie neurologiquement intacte dans un modèle de rat où les rats étaient réanimés à partir de 10 min d'AC asphyxique. Cette amélioration de la survie était associée à des améliorations du métabolisme, du débit sanguin cérébral et de l'œdème pulmonaire. Nos études in vitro confirment que les cultures de cellules neurales absorbent facilement les mitochondries exogènes du donneur fraîchement isolées et que les mitochondries du donneur sont capables de respirer et de produire de l'ATP. Des études de suivi in ​​vivo ont déterminé que des mitochondries de donneurs transplantés par perfusion intraveineuse peuvent être trouvées dans les tissus 24 h après l'AC.

Notre principale conclusion était que MTx améliorait la survie de 55 à 91 % après l'AC. Nous n'avons pas pu trouver d'études antérieures sur MTx dans le cadre de l'AC ; cependant, MTx a été signalé comme étant protecteur dans d'autres modèles de maladies animales, telles que l'I/R cardiaque [10,11,12,13,14,15,16,17], les accidents vasculaires cérébraux [6, 18], l'I/R hépatique [30, 31], I/R rénale [32, 33], I/R pulmonaire [25], lésion médullaire [34], Parkinson [35, 36] et schizophrénie [37]. Par exemple, dans un modèle d'AVC chez la souris, des mitochondries dérivées du tissu placentaire ont été infusées par voie intraveineuse à des animaux après une occlusion focale de la carotide, ce qui a entraîné une réduction significative de la taille de l'infarctus en 72 h [18]. Dans le cerveau ischémique, les astrocytes peuvent transférer des mitochondries saines dans des neurones endommagés [6]. Une autre étude a montré que la transplantation de mitochondries dérivées du muscle réduisait le stress oxydatif cellulaire et l'apoptose, diminuait le volume de l'infarctus cérébral et renversait les déficits neurologiques après un AVC ischémique chez le rat [38].

Nous avons également vérifié que le processus de congélation-décongélation réduit considérablement la teneur en ATP et ΔψM dans les particules mitochondriales isolées. Cette découverte est importante pour deux raisons : (1) elle valide que notre utilisation de la procédure d'isolement rapide, rapportée par McCully et al., a abouti à l'extraction de mitochondries fonctionnelles génératrices d'ATP, et (2) la congélation et la décongélation des mitochondries. ont produit des mitochondries relativement non fonctionnelles qui sont utilisées pour la série suivante comme groupe témoin négatif supplémentaire critique. Il convient de noter que la plupart des études antérieures sur MTx utilisaient la solution de véhicule simple seule comme groupe témoin négatif unique [10, 11, 12, 13, 14, 16, 18, 25, 33, 35, 36, 37, 39]. Pour notre enquête MTx, nous voulions confirmer que c'était la capacité fonctionnelle des mitochondries infusées qui est requise pour les changements de résultat, et non en raison de l'infusion d'un autre composant présent dans des particules mitochondriales non fonctionnelles. Les particules mitochondriales gelées-décongelées non fonctionnelles contiennent des quantités similaires de membranes mitochondriales, de protéines et d'autres macromolécules, et il est raisonnable de croire que certains de ces composants pourraient avoir une activité biologique, agissant peut-être comme des modèles moléculaires associés aux dommages ou des molécules de signalisation. L'utilisation de mitochondries congelées-décongelées comme contrôle négatif supplémentaire nous permet d'éliminer un important facteur de confusion possible.

La traduction de nos découvertes chez l'homme pourrait se produire rapidement, d'autant plus que certains essais humains utilisant MTx ont déjà été réalisés, d'autres sont en cours et d'autres sont prévus. MTx a déjà été utilisé chez des patients pédiatriques atteints d'ischémie myocardique après chirurgie cardiaque [39, 40]. Guariento et al. ont rapporté des patients pédiatriques atteints de cardiopathie congénitale sévère sur des machines cœur-poumon qui ont reçu une injection de leurs propres mitochondries. Dans leur étude, la MTx a été réalisée pour accélérer le processus de sevrage et un certain degré de succès a été rapporté [39, 40]. De plus, une étude humaine est en cours pour étudier l'innocuité du MTx autologue délivré au cerveau pendant l'ischémie cérébrale. Walker et al. biopsié le tissu musculaire d'un patient pour isoler les mitochondries au chevet du patient et infusé les mitochondries fraîchement isolées directement dans le cerveau du patient (NCT04998357). Nous espérons que la série d'études présentées ici stimulera davantage la recherche dans ce domaine.

Dans notre étude, nous avons démontré que les mitochondries exogènes migrent dans les milieux de culture et co-localisent avec les mitochondries endogènes dans la culture de cellules neurales par simple co-culture pendant 24 h. La capacité des mitochondries à migrer d'une cellule à une autre est une découverte récente et est actuellement un phénomène mal compris. Nos résultats confirment que les mitochondries se transfèrent facilement à travers la membrane cellulaire ; il peut s'agir d'un événement naturel qui se produit plus souvent qu'on ne le pensait auparavant. Diverses études appuient nos découvertes in vitro. Andrabi et al. ont démontré le transfert des mitochondries des astrocytes et de la microglie vers les neurones endommagés [41]. Hayakawa et al. ont découvert que les mitochondries libérées dans l'espace extracellulaire peuvent être transférées d'une cellule à l'autre dans le cerveau après un AVC. Ces résultats suggèrent un nouveau mécanisme mitochondrial de diaphonie neurogliale qui pourrait contribuer à la neuroprotection endogène après une lésion cérébrale I/R [6, 18]. Spee et al. ont démontré le transfert intercellulaire de mitochondries normales de cellules souches mésenchymateuses vers des cellules de mammifères hébergeant des mitochondries dysfonctionnelles [42]. Ainsi, les mitochondries sont de plus en plus considérées comme jouant un rôle important dans la communication et le fonctionnement de cellule à cellule [41,42,43,44], et le transfert de mitochondries des cellules saines vers les cellules endommagées semble être une approche thérapeutique prometteuse [6 , 8, 9]. D'autres études sont nécessaires pour déterminer les mécanismes précis par lesquels les mitochondries exogènes sont absorbées par les cellules pendant l'I/R et pour élucider comment les mitochondries extracellulaires maintiennent leur viabilité, migrent dans les tissus et agissent pour protéger les tissus pendant le processus de transplantation.

Nos résultats de mesures d'expression génique suggèrent que la dynamique mitochondriale est déplacée vers la fission dans le groupe mito frais pendant une phase de récupération chez les animaux survivants ressuscités de l'AC, ce qui pourrait être associé aux effets bénéfiques de la supplémentation en mitochondries fraîches. Il a été démontré que l'inhibition de la fission mitochondriale par l'inhibiteur de Drp1 produisait des effets bénéfiques contre les lésions cérébrales après ischémie globale et reperfusion [45]. En revanche, une étude précédente a démontré que l'inhibition de la fission en inhibant Drp1 ou siRNA a contribué à augmenter les lésions médiées par les mitochondries endommagées telles que la génération de ROS, la libération de cytochrome c et l'activation de la caspase-3 après une lésion ischémique-hypoxique, aggravant les lésions cérébrales ischémiques. [46]. Il a été démontré que la fission mitochondriale permet aux mitochondries de séparer les mitochondries dysfonctionnelles qui contiennent des protéines endommagées, de l'ADN muté ou des membranes déstabilisées [47]. Ces résultats contradictoires suggèrent que l'équilibre entre la fission et la fusion et son rôle dans la récupération du cerveau n'ont pas encore été élucidés. De plus, le rôle de la dynamique mitochondriale reste incomplètement étudié non seulement pour la phase aiguë mais aussi pour la phase de récupération tardive après une lésion d'ischémie-reperfusion. D'autres investigations sont justifiées pour élucider le rôle de MTx sur la dynamique mitochondriale et les lésions cérébrales après la réanimation CA.

Une découverte importante dans notre étude est la persistance de mitochondries marquées par fluorescence dans les tissus critiques des animaux 24 h après l'AC. À ce jour, il existe peu de littérature sur l'emplacement anatomique où les mitochondries circulantes du donneur sont absorbées après une perfusion intraveineuse. Un certain nombre d'études antérieures ont étudié l'injection directe de mitochondries dans le muscle cardiaque et l'injection intracoronaire. Ces études ont démontré la rétention des mitochondries du donneur dans les zones ischémiques du cœur mais pas dans les autres organes [10, 11, 16]. En revanche, une étude de Nakamura et al., utilisant la même perfusion intraveineuse que nous avons effectuée, a démontré qu'en plus de trouver des mitochondries dans les régions cérébrales ischémiques après un AVC, des mitochondries infusées ont également été identifiées dans divers organes périphériques, notamment les poumons, le foie, rein et cœur [18]. Une étude récente de Shi et al. a démontré des améliorations fonctionnelles dans la maladie de Parkinson à la suite de MTx. Leur étude a déterminé la distribution étendue des mitochondries exogènes infusées par voie intraveineuse dans de nombreux tissus différents, y compris le cerveau, le foie, les reins, les muscles et le cœur, et a émis l'hypothèse que la maladie de Parkinson pourrait être en partie causée par les séquelles d'organes multiples de la maladie mitochondriale [36]. Bien que nous ayons identifié l'absorption de mitochondries exogènes de donneurs dans plusieurs organes 24 h après l'AC, le mécanisme d'absorption cellulaire des mitochondries infusées reste inconnu. Il a été suggéré que les mitochondries exogènes pourraient entrer via les voies d'endocytose cellulaire [48,49,50]. D'autres études sont justifiées pour déterminer les mécanismes d'absorption transmembranaire, définir quels tissus et cellules absorbent les mitochondries les plus infusées et délimiter davantage la chronologie de la persistance des mitochondries transplantées dans les tissus ciblés.

Unique à notre étude est l'utilisation de mitochondries congelées-décongelées non fonctionnelles comme contrôle négatif supplémentaire. Ces mitochondries congelées-décongelées n'avaient aucun des effets protecteurs observés avec les mitochondries fraîchement isolées. Cela suggère des exigences pour une respiration relativement saine et des mitochondries productrices d'ATP pour une transplantation réussie. D'autres études ont démontré que MTx peut améliorer les niveaux d'ATP [51], protéger les peptides mitochondriaux, prévenir les réponses pro-inflammatoires excessives [52] et réduire l'activation de la voie de mort cellulaire [53]. Néanmoins, de nombreuses questions importantes demeurent.

Les études préliminaires présentées ici présentent un certain nombre de limites. Le mécanisme précis par lequel MTx a amélioré les résultats de survie reste inconnu. Nous devons encore déterminer si les niveaux d'ATP dans les tissus receveurs sont modifiés avec MTx. Nous n'avons pas quantifié le nombre de mitochondries absorbées, ni déterminé si les tissus qui absorbent les mitochondries étaient les tissus les plus responsables de l'amélioration des résultats. De plus, notre dosage et notre timing de MTx peuvent ne pas être optimaux. Notre modèle animal CA est un modèle de 72 h à relativement court terme ; par conséquent, les avantages à plus long terme (ou les effets indésirables) restent inconnus. Bon nombre de nos mesures ont été prises à des moments précis; ainsi, nous n'avons peut-être pas réussi à détecter des changements significatifs qui se produisent à d'autres moments. Pour la traduction en thérapies humaines, des études supplémentaires sont nécessaires pour élucider la dose optimale de mitochondries du donneur, les méthodes d'isolement optimales et le moment idéal de MTx pour traiter les blessures I/R. De plus, nous avons concentré ces études sur le MTx allogénique ; cependant, cela peut ne pas être faisable dans le cadre clinique aigu. Pour le développement de thérapies humaines pragmatiques, la possibilité de la xénotransplantation, par opposition à la transplantation allogénique ou autologue, a été suggérée comme une future direction viable [11, 54, 55].

Nous avons constaté que la MTx effectuée immédiatement après la réanimation de l'AC améliorait la survie et la récupération neurologique chez les rats. Le MTx était associé à une récupération rapide des taux de lactate, de pH et de glucose ; amélioration de la microcirculation et de la perfusion cérébrale ; et une diminution des lésions pulmonaires. Ces résultats fournissent une base pour de futures études visant à améliorer notre compréhension de base de la biologie mitochondriale et à promouvoir le développement de MTx en tant que nouvelle stratégie thérapeutique pour sauver des vies actuellement perdues après l'AC.

Les ensembles de données utilisés et/ou analysés au cours de l'étude actuelle sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande raisonnable.

Transplantation mitochondriale

Arrêt cardiaque

L'adénosine triphosphate

Ischémie et reperfusion

Solution saline tamponnée au phosphate

Albumine de sérum bovin

Potentiel de membrane mitochondriale

Cyanure de carbonyle 3-chlorophénylhydrazone

Fréquence respiratoire

Volume courant

Score de la fonction neurologique

Fraction d'éjection ventriculaire gauche

Rapport poids humide/sec

Protéine liée à la dynamine 1

Protéine mitochondriale de fission 1

Atrophie optique-1

Mitofusine-1

Mitofusine-2

Cytochrome c oxydase

Débit sanguin cérébral relatif

Régions d'intérêt

4,6-diamidino-2-phénylindole

Analyse de variance

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Cette étude a été soutenue par un fonds du Laboratoire de physiologie des soins intensifs, Feinstein Institutes for Medical Research, Northwell Health.

Laboratoire de physiologie des soins intensifs, The Feinstein Institutes for Medical Research, Northwell Health, Manhasset, NY, États-Unis

Kei Hayashida, Ryosuke Takegawa, Yusuke Endo, Tai Yin, Rishabh C. Choudhary, Tomoaki Aoki, Mitsuaki Nishikimi, Eriko Nakamura, Muhammad Shoaib, Cyrus Kuschner, Santiago J. Miyara, Junhwan Kim, Koichiro Shinozaki et Lance B. Becker

Centre d'immunologie et d'inflammation, The Feinstein Institutes for Medical Research, Northwell Health, Manhasset, NY, États-Unis

Atsushi Murao et Ping Wang

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Conceptualisation : KH et LBB. Méthodologie : KH, RT, YE, TY, RCC, TA, MN, AM, EN, MS, CK, SJM, JK, KS, PW et LBB. Enquête : KH, RT, YE, TY, RCC, MN, AM et EN. Visualisation : KH. Acquisition de financement : KH et LBB. Administration du projet : LBB. Rédaction—ébauche originale : KH. Révision et édition : KH et LBB. Les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Kei Hayashida ou Lance B. Becker.

N'est pas applicable.

N'est pas applicable.

Les auteurs déclarent n'avoir aucun intérêt concurrent.

Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

Sang artériel et mesures métaboliques prélevés au départ avant l'arrêt et à 15 et 120 minutes après la réanimation. Figure S2. L'activité de la cytochrome c oxydase (COX) dans les homogénats tissulaires du cerveau et de la rate des animaux survivants 72 h après l'AC dans le groupe véhicule, congelé-décongelé ou mito frais. Figure S3. Imagerie de fluorescence confocale pour le cœur, le foie et les poumons 24 h après la réanimation CA chez des rats traités avec un véhicule ou une transplantation mitochondriale fraîche.

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Réimpressions et autorisations

Hayashida, K., Takegawa, R., Endo, Y. et al. La transplantation mitochondriale exogène améliore la survie et les résultats neurologiques après la réanimation d'un arrêt cardiaque. BMC Med 21, 56 (2023). https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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Reçu : 04 octobre 2022

Accepté : 30 janvier 2023

Publié: 16 mars 2023

DOI : https://doi.org/10.1186/s12916-023-02759-0

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