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Nov 23, 2023

bêta2

npj Maladie de Parkinson

npj Parkinson's Disease volume 8, Article number: 61 (2022) Citer cet article

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Les agonistes des récepteurs β2-adrénergiques (β2AR) ont été associés à une diminution du risque de développer la maladie de Parkinson (MP) et sont supposés diminuer l'expression de l'ARNm de l'alpha-synucléine (Snca) et de la protéine (α-syn). Les effets du clenbutérol agoniste β2AR sur les niveaux d'ARNm Snca et de protéine α-syn ont été évalués in vivo (rats et souris) et dans les neurones corticaux primaires de rat par deux laboratoires indépendants. Une diminution modeste de l'ARNm de Snca dans la substantia nigra a été observée après une seule dose aiguë de clenbutérol chez le rat, cependant, cette diminution n'a pas été maintenue après plusieurs doses. En revanche, les niveaux de protéine α-syn sont restés inchangés dans les paradigmes de dosage unique et multiple. De plus, le clenbutérol n'a pas diminué la Snca dans les neurones corticaux primaires de rat en culture, ni diminué la Snca ou l'α-syn chez la souris. De plus, par rapport au paradigme à dose unique, l'administration répétée a entraîné des niveaux sensiblement inférieurs de clenbutérol dans le plasma et les tissus cérébraux chez les rongeurs. Sur la base de nos observations d'une diminution transitoire de Snca et de l'absence d'effet sur la protéine α-syn dans cette étude préclinique, ces données étayent la conclusion selon laquelle le clenbutérol n'est probablement pas une stratégie de modification de la maladie viable pour la MP.

La formation et l'accumulation de corps de Lewy intracellulaires (LB) est une caractéristique pathologique clé de la maladie de Parkinson (MP). Un composant principal des LB est la protéine alpha-synucléine (α-syn), en particulier α-syn, qui est mal repliée, agrégée et phosphorylée au niveau de la sérine 129 (pSyn)1,2,3,4,5. L'agrégation d'α-syn se produit dans les formes idiopathiques et la plupart des formes familiales de MP. Des mutations dans le gène qui code pour α-syn (ci-après dénommé SNCA lorsqu'on parle d'humains et Snca lorsqu'on parle de rongeurs), ainsi que la duplication et la triplication de SNCA, peuvent augmenter la propension de α-syn à s'agréger6,7,8,9. La duplication ou la triplication des SNCA produit un effet de dosage génique, la triplication par rapport à la duplication entraînant une apparition plus précoce des symptômes et une progression plus rapide de la maladie10.

Bien que l'α-syn soit couramment discutée comme une cause pathologique qui forme des agrégats associés à l'état pathologique, la forme monomérique soluble est un composant crucial de la fonction neuronale. Il a été proposé que l'α-syn joue un rôle dans le trafic et la neurotransmission des vésicules synaptiques, la fonction mitochondriale, la biosynthèse et le traitement de la dopamine, la fonction de la protéine chaperonne, la réparation de l'ADN et l'expression des gènes, entre autres fonctions prédites11,12,13,14,15,16, 17,18,19,20. Des niveaux inadéquats d'α-syn ont le potentiel d'être préjudiciables aux neurones et à la fonction neuronale, c'est pourquoi un renversement ou une élimination complète de l'α-syn induirait probablement des effets secondaires indésirables21,22. En effet, des modèles de souris transgéniques ont montré que le knock-out de Snca seul est insuffisant pour produire des effets23,24, et des knock-out simultanés de Snca, Sncb et Sncg sont nécessaires pour produire des déficits robustes25,26,27. Ces modèles transgéniques s'accompagnent de la mise en garde d'importants mécanismes compensatoires associés au manque de Snca dès la naissance, avec pas moins de 369 gènes exprimés de manière différentielle signalés chez les souris Snca-/-28.

Les données cumulatives suggèrent que des réductions modérées de α-syn détiennent le meilleur potentiel en tant que stratégie thérapeutique, c'est-à-dire une diminution des niveaux de α-syn tout en maintenant le seuil critique requis pour éviter les effets potentiels de perte de fonction dans les neurones. Néanmoins, la modulation des niveaux α-syn dans le cerveau n'est pas anodine. Les modèles animaux dans lesquels l'expression génique a été modifiée via des shARN ou des nucléotides antisens ont eu des résultats mitigés, certaines études montrant une toxicité29,30, tandis que d'autres non31,32,33,34. Comme alternative, les interventions pharmaceutiques peuvent fournir une approche supérieure pour produire une diminution modeste mais physiologiquement significative de l'α-syn.

Il a été rapporté que les médicaments ciblant le récepteur β2-adrénergique (β2AR) modulent les niveaux α-syn et affectent le risque de MP35,36,37,38,39,40. Des études basées sur la population ont rapporté une association entre l'utilisation d'agonistes β2AR et une diminution du risque de MP37,38, bien que d'autres aient contesté ces résultats, trouvant que les agonistes β2AR seuls n'ont pas d'impact sur le risque de MP39,40. Au-delà des résultats incohérents entourant ces études d'association, les preuves précliniques chez les rongeurs et la culture cellulaire suggèrent que les médicaments agissant sur β2AR peuvent influencer l'expression α-syn37. Plus précisément, il a été rapporté que les agonistes β2AR diminuent l'ARNm de Snca et la protéine α-syn in vivo et in vitro37. À l'inverse, il a été rapporté que les antagonistes des β2AR augmentaient l'ARNm de Snca et la protéine α-syn en culture37. On suppose que l'altération des niveaux α-syn via β2AR se produit par régulation transcriptionnelle par acétylation ou désacétylation de H3K27 le long des sites promoteur et amplificateur Snca; avec des agonistes β2AR ou des antagonistes β2AR conduisant respectivement à une diminution ou à une augmentation du H3K27 acétylé permissif, impactant ainsi la transcription de Snca37. De plus, le clenbutérol, un agoniste β2AR, a été signalé comme étant bénéfique dans les modèles qui récapitulent les caractéristiques de la MP. Plus précisément, le clenbutérol diminue l'ARNm SNCA et la protéine α-syn dans les CSPi humains à triplication SNCA et prévient la neurodégénérescence dans le modèle murin 1-méthyl-4-phényl-1,2,3,6-tétrahydropyridine (MPTP) de PD37.

La présente série d'expériences est l'aboutissement de travaux effectués indépendamment dans des laboratoires de la Michigan State University (MSU) et de Biogen. Dans ces expériences, nous avons cherché à reproduire et à nous appuyer sur les découvertes originales selon lesquelles les agonistes β2AR, en particulier le clenbutérol, réduisent l'ARNm Snca et la protéine α-syn chez les rongeurs et la culture cellulaire37. Cependant, le paradigme de dosage du clenbutérol utilisé chez les rats n'a pas entraîné de diminution de la protéine α-syn dans les études aiguës ou de modifications de la protéine Snca ou α-syn après plusieurs doses. Les études de réplication directe chez la souris reflétaient les résultats observés chez le rat, sans réduction significative de la protéine Snca ou α-syn observée après une ou plusieurs doses de clenbutérol. De plus, il n'y avait aucun changement dans Snca dans les cultures corticales primaires de rat. Pris ensemble, les résultats suggèrent que toute réduction du transcrit α-syn après le clenbutérol est transitoire et n'entraîne pas une réduction de l'abondance de la protéine α-syn. Ainsi, nous concluons qu'il est peu probable que le clenbutérol se traduise par un traitement efficace de la maladie de Parkinson.

Nous avons d'abord confirmé que les neurones dopaminergiques nigrostriés de rat expriment β2AR en utilisant l'hybridation in situ (Adrb2) combinée à l'immunohistochimie (IHC) pour la tyrosine hydroxylase (TH) dans la substantia nigra (SN). Des points ponctuels d'ARNm Adrb2 abondants ont été observés dans des neurones nigras TH immunoréactifs (THir) individuels (Fig. 1a).

Les rats ont reçu une seule injection intrapéritonéale de 10, 20 ou 40 mg/kg de clenbutérol (clen) ou de véhicule salin (veh) et les tissus ont été prélevés 24 h après l'injection. une image représentative de l'hybridation in situ pour l'ARNm d'Adrb2, qui code pour β2AR, colocalisé dans des neurones immunoréactifs à la tyrosine hydroxylase (TH) dans le SNpc d'un rat non traité. b Snca normalisé à Gapdh et mesuré via ddPCR. c Fraction α-syn facilement soluble isolée du SN. d Fraction α-syn initialement insoluble isolée du SN, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. e Fraction α-syn facilement soluble isolée du striatum. f Fraction α-syn initialement insoluble isolée du striatum, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. Toutes les fractions protéiques ont été mesurées par western blot, représentées graphiquement en pourcentage du contrôle, et des transferts représentatifs sont présentés sous le graphique respectif. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 10 par groupe avant la suppression des valeurs aberrantes), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05). Les valeurs aberrantes ont été supprimées en fonction de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane. En b, un échantillon a été retiré des groupes veh, 10 et 40 mg/kg, et deux échantillons ont été retirés du groupe 20 mg/kg. Aucune autre valeur aberrante n'a été supprimée.

Sur la base d'injections intrapéritonéales (ip) produisant des niveaux significativement plus élevés de clenbutérol dans le LCR par rapport aux injections sous-cutanées (Fig. 1 supplémentaire), l'administration ip a été sélectionnée. Pour refléter les études précédentes37, nous avons administré une seule injection (ip) de 10, 20 ou 40 mg/kg de clenbutérol ou de véhicule (solution saline), l'ARNm Snca et la protéine α-syn ont été évalués dans le SN, et la protéine α-syn dans le striatum 24 h plus tard (voir plan expérimental, Fig. 2 supplémentaire). Une diminution modeste mais significative de Snca dans le SN a été observée en utilisant la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) chez des rats ayant reçu une seule injection de 10 ou 20 mg/kg de clenbutérol (Fig. 1b). La Snca a été réduite d'environ 20 % par les doses de 10 mg/kg et de 20 mg/kg, alors qu'aucune réduction significative de la Snca n'a été observée chez les rats recevant la dose la plus élevée, 40 mg/kg (Fig. 1b).

La préparation d'échantillons nigras et striataux de rat pour la mesure de la protéine α-syn a été réalisée à l'aide d'une lyse en deux étapes. La première étape a utilisé un tampon de lyse faible et une homogénéisation au pilon, pour reproduire les procédures d'isolement des protéines comme précédemment rapporté37, appelées "α-syn soluble". La deuxième étape a utilisé un tampon de test de radio-immunoprécipitation (RIPA) fort et une sonication du culot restant de la première étape, appelé « α-syn insoluble ». Nous n'avons observé aucun impact d'injections ip uniques de clenbutérol chez des rats sur les niveaux de protéines α-syn solubles ou insolubles dans le SN en utilisant n'importe quelle dose de clenbutérol (Fig. 1c, d). De même, les transferts Western pour l'α-syn facilement soluble et insoluble dans le striatum n'ont montré aucun changement avec l'administration de clenbutérol (Fig. 1e, f).

L'absence de diminution de la protéine α-syn observée après une administration unique de clenbutérol, contrairement à la diminution observée du transcrit, pourrait être due à une dégradation/clairance inadéquate de la protéine sur l'intervalle de 24 h. Cela suggère qu'avec un temps suffisant, des réductions de la protéine α-syn peuvent être observables. Ainsi, pour déterminer l'impact de l'administration de clenbutérol sur un paradigme de dosage multiple plus long, nous avons examiné les niveaux d'ARNm Snca et de protéine α-syn avec 1 semaine d'administration répétée de clenbutérol (Fig. 3 supplémentaire). Les rats ont reçu une injection ip toutes les 48 h pour un total de quatre doses, sur la base de la demi-vie de 30 h rapportée du clenbutérol dans le plasma avec administration orale41. Les rats des groupes de clenbutérol ont démontré une perte de poids notable par rapport aux témoins avec les trois doses à 2, 4, 6 et 7 jours après le début de la série d'injections (Fig. 4 supplémentaire). Lorsque l'ARNm de Snca a été examiné, nous n'avons observé aucun changement de Snca dans le SN avec n'importe quelle dose dans le paradigme d'injection multiple, contrairement aux résultats du paradigme d'injection unique (Fig. 2a). Les transferts Western pour α-syn soluble et insoluble dans le SN et le striatum n'ont également montré aucun changement en réponse à une dose de clenbutérol (Fig. 2b – e).

Les rats ont reçu des injections intrapéritonéales de 10, 20 ou 40 mg/kg de clenbutérol (clen) ou de véhicule salin (veh) toutes les 48 h. Les tissus ont été prélevés le 7e jour, 24 h après la dernière injection. Avant chaque injection, les rats ont été pesés pour calculer le volume de médicament ou de véhicule requis pour la dose. a Snca normalisé à Gapdh et mesuré via ddPCR. b Fraction α-syn facilement soluble isolée du SN. c Fraction α-syn initialement insoluble isolée du SN, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. d Fraction α-syn facilement soluble isolée du striatum. e Fraction α-syn initialement insoluble isolée du striatum, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. Toutes les fractions protéiques ont été mesurées par western blot, représentées graphiquement en pourcentage du contrôle, et des transferts représentatifs sont présentés sous le graphique respectif. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 10 par groupe avant la suppression des valeurs aberrantes), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05). Les valeurs aberrantes ont été supprimées en fonction de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane. En a, deux échantillons ont été retirés des groupes à 20 mg/kg et un échantillon a été retiré des groupes à 40 mg/kg. En b, deux échantillons ont été retirés du groupe de 40 mg/kg. En c et e, un échantillon a été retiré du groupe de 40 mg/kg. Aucune autre valeur aberrante n'a été supprimée.

Mittal et al.37 ont déjà examiné les effets du clenbutérol sur l'expression α-syn chez la souris. Dans leur étude, les souris ont reçu soit une seule injection ip de clenbutérol (10 mg/kg) dissous dans une solution saline, soit un volume égal de solution saline comme témoin. Les animaux ont été traités 24 h après l'injection et une diminution de 20 à 50 % de l'ARNm Snca et de la protéine α-syn a été signalée dans le SN37. Pour déterminer si les effets du clenbutérol sont spécifiques aux souris, nous avons réalisé une étude utilisant des paramètres identiques à ceux rapportés précédemment (Fig. 2 supplémentaire)37.

Dans le SN, l'ARNm de Snca chez les animaux traités au clenbutérol avait tendance à diminuer, mais l'effet n'était pas significatif (Fig. 3a). Les résultats d'une étude répétée réalisée chez Biogen en utilisant le même paradigme de dose unique et le même point temporel n'ont également observé aucun changement dans l'ARNm de Snca (Fig. 3b). L'évaluation de la protéine α-syn par western blot a de nouveau été effectuée en utilisant une lyse en deux étapes. Dans les fractions solubles et insolubles, nous n'avons observé aucune diminution de la protéine α-syn dans le SN (Fig. 3c, d). Dans le striatum, il y a eu une augmentation significative quoique légère de l'α-syn soluble dans le groupe clenbutérol, qui était de 109, 1% ± 2, 41 du contrôle (Fig. 3e). Il n'y avait cependant aucune augmentation détectable de l'α-syn insoluble dans le groupe traité au clenbutérol (Fig. 3f).

Les souris ont reçu une seule injection intrapéritonéale de 10 mg/kg de clenbutérol (clen) ou de véhicule salin (veh) et les tissus ont été prélevés 24 h après l'injection. a Snca normalisé à Gapdh et mesuré via ddPCR. b Résultats du laboratoire Biogen, ARNm Snca normalisé à l'ARNm Rpl13a et mesuré via RT-qPCR. c Fraction α-syn facilement soluble isolée du SN. d Fraction α-syn initialement insoluble isolée du SN, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. e Fraction α-syn facilement soluble isolée du striatum. f Fraction α-syn initialement insoluble isolée du striatum, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. Toutes les fractions protéiques ont été mesurées par western blot, représentées graphiquement en pourcentage du contrôle, et des transferts représentatifs sont présentés sous le graphique respectif. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 10 par groupe avant la suppression des valeurs aberrantes), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05). Les valeurs aberrantes ont été supprimées en fonction de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane. En a, deux échantillons ont été retirés du veh et un échantillon retiré des groupes clen. Aucune autre valeur aberrante n'a été supprimée.

Compte tenu de la possibilité que l'apparition des effets du clenbutérol puisse être retardée, nous avons examiné l'impact d'injections multiples de 10 mg/kg de clenbutérol chez la souris pendant 1 semaine (Fig. 3 supplémentaire). Il n'y avait aucun changement dans l'ARNm de Snca dans le SN après 1 semaine de paradigme de traitement (Fig. 4a). De même, nous n'avons observé aucun impact des injections multiples sur la protéine α-syn dans le SN de souris par western blot, que ce soit dans la fraction soluble ou insoluble (Fig. 4b, c). De même, il n'y a eu aucun changement dans les fractions α-syn insolubles ou insolubles dans le striatum après 1 semaine (Fig. 4d, e). Par rapport au véhicule, les souris recevant du clenbutérol ont perdu du poids au début de ce paradigme de dosage, mais se sont rétablies et n'ont pas montré de perte de poids significative au quatrième jour d'injection et au-delà (Fig. 4 supplémentaire).

Les souris ont reçu des injections intrapéritonéales de 10 mg/kg de clenbutérol (clen) ou de véhicule salin (veh) toutes les 48 h. Les tissus ont été prélevés le 7e jour, 24 h après la dernière injection. a Snca normalisé à Gapdh et mesuré via ddPCR. b Fraction α-syn facilement soluble isolée du SN. c Fraction α-syn initialement insoluble isolée du SN, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. d Fraction α-syn facilement soluble isolée du striatum. e Fraction α-syn initialement insoluble isolée du striatum, solubilisée avec un tampon de lyse plus fort. Toutes les fractions protéiques ont été mesurées par western blot, représentées graphiquement en pourcentage du contrôle, et des transferts représentatifs sont présentés sous le graphique respectif. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 10 par groupe avant la suppression des valeurs aberrantes), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05). Les valeurs aberrantes ont été supprimées en fonction de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane. En a, un échantillon a été retiré des groupes veh et clen. Aucune autre valeur aberrante n'a été supprimée.

Comme des diminutions de la protéine α-syn ont été montrées via un immunoessai lié à une enzyme (ELISA) dans le rapport original37, nous avons également analysé des cohortes de souris à l'aide d'un ELISA disponible dans le commerce. Nous n'avons observé aucun impact du clenbutérol sur les niveaux de protéines α-syn solubles ou insolubles dans le SN ou le striatum à 24 h chez les souris traitées de manière aiguë (Fig. 5a, c, e, g). Dans le paradigme d'une semaine, il n'y avait aucun changement dans les niveaux de protéines α-syn solubles ou insolubles dans le SN, et aucun changement dans les niveaux de protéines α-syn solubles dans le striatum (Fig. 5b, d, f). Nous avons observé une augmentation significative de la protéine α-syn dans le striatum dans la fraction insoluble, 34,9 ± 1,9 pg/µg dans le groupe clenbutérol 1 semaine contre 27,9 ± 1,6 pg/µg dans le groupe témoin véhicule (Fig. 5h) . Les ELISA et une partie des transferts Western dans le rapport original utilisaient un anticorps α-syn différent (Millipore, MABN1817, clone α-syn 2F12) que nous avons utilisé (Abcam, ab212184). Malheureusement, nous n'avions pas de lysat restant du SN pour faire une deuxième évaluation des niveaux d'α-syn en utilisant cet autre anticorps. Cependant, pour remédier à cette différence, nous avons en outre interrogé la fraction soluble du striatum. Encore une fois, il n'y a eu aucun changement par western blot dans la fraction soluble de la strate dans le paradigme de 24 h ou 1 semaine en utilisant l'anticorps MABN1817 (Fig. 5 supplémentaire).

Un kit ELISA disponible dans le commerce a été utilisé pour mesurer α-syn dans le plasma et les lysats de protéines restants des paradigmes de dosage de 10 mg/kg de souris à 1 jour et à 1 semaine. α-syn facilement soluble isolé du SN à 1 jour et b 1 semaine. α-syn initialement insoluble isolé de SN, solubilisé avec un tampon de lyse plus fort à c 1 jour et d 1 semaine. α-syn soluble du striatum à e 1 jour et f 1 semaine. α-syn insoluble du striatum à g 1 jour et h 1 semaine. α-syn totale dans le plasma à i 1 jour et j 1 semaine. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 10 par groupe avant la suppression des valeurs aberrantes), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05). Les valeurs aberrantes ont été supprimées en fonction de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane. Dans a, aucune valeur aberrante n'a été supprimée, la petite taille de l'échantillon dans le groupe veh était due à la quantité limitée de protéines restantes pour le test. En b, un échantillon a été retiré des groupes veh et clen. En i, j, un échantillon a été retiré du groupe veh. Aucune autre valeur aberrante n'a été supprimée.

Une différence restante entre notre préparation d'échantillon et celle de Mittal et al.37 était que tous les rats et souris de nos études étaient perfusés avec une solution saline pour éliminer le potentiel de protéine α-syn dans le sang qui contribuerait aux niveaux de α-syn du tissu cérébral. . Pour déterminer si le clenbutérol a un impact sur les niveaux de protéines α-syn dans le sang, nous avons mesuré la protéine α-syn dans le plasma. Nous n'avons observé aucune différence dans les taux plasmatiques de protéines α-syn chez les souris pour le paradigme de 24 h ou d'une semaine après l'injection de 10 mg / kg de clenbutérol (Fig. 5i, j).

Collectivement, nous avons observé, chez les rats et les souris, que la capacité du clenbutérol à réduire l'α-syn était limitée à une réduction du transcrit α-syn après une seule injection, ce qui n'était plus observable dans le paradigme de l'injection multiple. Le β2AR est sujet à une désensibilisation avec une exposition chronique aux agonistes42. La désensibilisation de β2AR peut être suivie par l'internalisation et/ou la régulation négative du récepteur. Pour examiner les changements potentiels de β2AR, les tissus du striatum et de l'hippocampe ont d'abord été homogénéisés dans un tampon de lyse puissant et évalués par western blot. La protéine β2AR totale était inchangée après une semaine de traitement au clenbutérol dans le striatum et l'hippocampe (Fig. 6a, b supplémentaires). Un marqueur du β2AR internalisé est la phosphorylation des sérines 355/356 par la kinase du récepteur couplé aux protéines G43. Le β2AR phosphorylé (ser355/356) était inchangé après une semaine de traitement au clenbutérol dans le striatum, ainsi que dans l'hippocampe (Fig. 6c, d supplémentaires). Pris ensemble, ces résultats ne confirment pas que l'internalisation ou la régulation à la baisse du récepteur β2AR s'est produite avec l'administration répétée de clenbutérol. Cependant, ces résultats ne peuvent pas exclure une désensibilisation fonctionnelle, où la liaison de l'agoniste produit une réponse plus faible.

Un paramètre supplémentaire que nous avons examiné était les niveaux de protéines du transporteur de la dopamine (DAT), qui est nécessaire à l'absorption du MPP+, le métabolite toxique du MPTP44,45. Non mesurée auparavant dans le contexte de l'utilisation du clenbutérol, une diminution du DAT induite par le clenbutérol pourrait potentiellement expliquer les effets neuroprotecteurs rapportés pour le clenbutérol dans le modèle de souris MPTP37. Dans le striatum de souris, une seule injection de 10 mg / kg de clenbutérol a réduit de manière significative les niveaux de protéines DAT d'environ 23% par rapport au témoin (Fig. 7a supplémentaire). Cette réduction du DAT striatal n'a pas été observée dans le paradigme de l'injection multiple (Fig. 7b supplémentaire). De plus, la protéine DAT striatale était inchangée chez les rats après une seule injection de clenbutérol ou après plusieurs injections (Fig. 7c, d supplémentaires).

Le clenbutérol dans le plasma et le cerveau (hippocampe) a été mesuré pour déterminer les niveaux présents chez les rats et les souris. Dans les paradigmes d'injection unique et multiple chez le rat, une augmentation dose-dépendante des niveaux de clenbutérol lié et non lié a été observée dans le plasma et les tissus (Fig. 6a, c, e). De manière frappante, les niveaux de clenbutérol mesurés chez les animaux recevant des injections multiples étaient significativement inférieurs à ceux de leurs homologues à injection unique (Fig. 6a, c, e). Les niveaux de clenbutérol dans la fraction liée des groupes à injection unique étaient environ 7, 14 et 32 ​​fois plus élevés que leurs homologues respectifs à injection multiple de 10, 20 et 40 mg/kg. Les niveaux de clenbutérol dans la fraction non liée des groupes d'injection unique étaient ~ 4, 10 et 10 fois plus élevés que leurs homologues respectifs à injection multiple de 10, 20 et 40 mg/kg. Les niveaux totaux de clenbutérol dans le plasma des groupes à injection unique étaient environ 4, 3 et 10 fois plus élevés que leurs homologues respectifs à injection multiple de 10, 20 et 40 mg/kg. Alors que l'augmentation dose-dépendante des niveaux de clenbutérol dans le plasma et les tissus était attendue, la diminution des niveaux après une série d'injections par rapport à une seule injection ne l'était pas. De même chez les souris, le clenbutérol dans le plasma et les tissus était plus faible après plusieurs injections par rapport à une seule injection (Fig. 6b, d, f). Dans le groupe à injection unique, les niveaux de clenbutérol dans les fractions liées et non liées étaient d'environ 7 et 3 fois plus élevés dans le plasma, respectivement, par rapport au groupe à injections multiples. Étant donné que les groupes d'injection unique et multiple ont été sacrifiés environ 24 h après leur dernière injection, on s'attendrait à ce que les niveaux de clenbutérol soient comparables ou plus élevés dans le groupe d'injection multiple en raison de l'accumulation.

Des tissus de l'hippocampe et du plasma de souris et de rats dans les paradigmes de 1 jour et 1 semaine ont été collectés. Le tissu a été traité pour séparer le clenbutérol (clen) qui interagissait et n'interagissait pas avec les protéines, produisant respectivement une fraction de clenbutérol lié et non lié. Lié au clenbutérol chez un rat et une souris b. Clenbuterol non lié chez le rat c et la souris d. Clenbutérol total dans le plasma de rats e et de souris f. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels (n = 5 par groupe), les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Une ligne reliant les colonnes indique la signification entre les groupes (p ≤ 0,05).

Semblable à Mittal et al.37, des neurones corticaux primaires de rat provenant d'embryons de rat E18 Sprague-Dawley ont été traités pendant 2 jours avec du clenbutérol (1, 5, 10 ou 20 µM), puis évalués pour l'ARNm de Snca par RT-qPCR. Contrairement au rapport précédent37, le clenbutérol n'a eu aucun effet sur le transcrit α-syn à aucune concentration (Fig. 7a). Le test de viabilité cellulaire correspondant n'a montré aucune toxicité significative associée à l'une des concentrations de clenbutérol utilisées. (Fig. 7b).

Les neurones corticaux primaires de rat E18 ont été traités avec du clenbutérol ou un véhicule. a Snca mesuré via RT-qPCR dans des neurones exposés à DIV11 et récoltés 2 jours plus tard. b Viabilité cellulaire des neurones primaires exposés à DIV11 et examinés 2 jours plus tard. Les colonnes indiquent les moyennes du groupe, les cercles représentent les points de données individuels de la même expérience, les barres d'erreur représentent ± 1 erreur standard de la moyenne. Un astérisque représente la signification (p ≤ 0,05).

L'utilisation d'agonistes et d'antagonistes β2AR en ce qui concerne la MP et le risque de MP a fait l'objet de débats. Il a été initialement démontré que les agonistes β2AR réduisaient le risque de MP dans une population norvégienne37. Lorsqu'elle a été examinée dans une cohorte américaine et ajustée pour le tabagisme, l'utilisation d'agonistes β2AR n'a eu aucun effet sur le risque de MP39. Une cohorte distincte d'Israël a également signalé l'utilisation d'agonistes β2AR pour réduire le risque de MP, même lorsque le tabagisme, la consommation d'alcool, la résidence et d'autres variables ont été pris en compte dans l'analyse38. Plus récemment, il a été rapporté que les agonistes β2AR réduisaient le risque de MP chez les patients non diabétiques tout en augmentant le risque chez les diabétiques40. En ce qui concerne les antagonistes des β2AR et la MP, il existe des rapports qui suggèrent un lien avec un risque accru37,38, ceux qui ne montrent aucune association46 et ceux qui ont observé une association jusqu'à ajustement pour une exposition soutenue, un décalage de 5 ans entre l'exposition et le diagnostic de MP, ou un propranolol antagoniste spécifique35,36,39,40. L'utilisation de propranolol associée à un risque accru de MP s'accompagne de la mise en garde qu'il est utilisé pour traiter le tremblement essentiel, qui est lui-même associé à un risque accru de MP38,39,40,47. En résumé, en l'absence de consensus clair dans les données d'association de population, des études de laboratoire contrôlées sont essentielles pour fournir des informations clés afin de déterminer le potentiel des agonistes β2AR pour le traitement de la MP.

Dans des études précliniques, il a été démontré que le clenbutérol chez des souris et des études de culture cellulaire diminuait l'expression de α-syn par le biais de modifications d'histones, entraînant des réductions de l'ARNm Snca et de la protéine α-syn après une seule administration37. Dans la présente étude, nous avons pu répliquer partiellement les observations de Mittal et al.37. Plus précisément, nous avons observé une réduction significative de l'ARNm de Snca ou une tendance à la diminution, mais nous n'avons détecté aucune réduction de la protéine α-syn après une seule injection de clenbutérol chez des rats ou des souris. Pour comprendre l'impact de l'administration répétée de clenbutérol sur l'ARNm de Snca et la protéine α-syn non examinés auparavant par Mittal et al.37, nous avons également examiné les effets dans un paradigme d'injections multiples. L'administration répétée de clenbutérol ne diminue pas la transcription ou la protéine chez les souris ou les rats. De plus, le clenbutérol n'a également aucun effet sur l'ARNm de Snca dans les cultures corticales primaires. Ainsi, alors que nos résultats actuels reproduisent la découverte précédente selon laquelle une seule administration de clenbutérol peut réduire l'ARNm de Snca, en élargissant notre analyse pour inclure l'effet de l'administration répétée de clenbutérol sur une semaine, nous avons révélé que toute réduction de l'ARNm de Snca apparaît à court terme. Fait important, l'impact sur la réduction de la protéine α-syn dans l'un ou l'autre des paradigmes d'administration de clenbutérol n'a pas été observé.

Il a été démontré que les agonistes des β2AR, le salmétérol et le clenbutérol, avaient des propriétés neuroprotectrices contre le MPTP37,48. Cependant, le mécanisme par lequel les agonistes β2AR ont fourni cette neuroprotection n'est pas clair et les résultats s'accompagnent de certaines mises en garde. Dans les deux rapports, l'agoniste β2AR a été administré avant et pendant les injections de MPTP37,48 offrant la possibilité d'une interaction médicamenteuse directe avec le MPTP, une diminution du métabolisme du MPTP par le MAO-B en son métabolite toxique MPP+, une diminution de l'absorption du MPP+ dans les neurones via DAT, ou réduction de la neuroinflammation. Dans notre présente étude, nous avons observé que l'administration aiguë de clenbutérol était associée à une petite réduction du DAT chez la souris. Cela soulève la possibilité que la réduction médiée par le clenbutérol des niveaux et/ou de la fonction de DAT ait interféré avec l'absorption de MPP+, diminuant ainsi la toxicité initiale du MPTP et produisant un effet pseudo-neuroprotecteur.

Bien que le MPTP produise une dégénérescence sélective de la voie nigro-striée, il ne produit pas de pathologie α-syn robuste49,50. L'absence d'inclusions α-syn pathologiques dans ce modèle suggère que la diminution médiée par le clenbutérol de l'α-syn pathologique n'est probablement pas le mécanisme de la neuroprotection rapporté dans le modèle MPTP37. Il est à noter que les souris nulles α-syn transgéniques sont résistantes à la toxicité aiguë et chronique induite par le MPTP, impliquant potentiellement une perte de α-syn dans la neuroprotection dans le modèle MPTP. Cependant, la résistance à la roténone, un inhibiteur du complexe mitochondrial I, n'est pas observée dans les neurones du mésencéphale embryonnaire nul α-syn51. Ces résultats quelque peu contradictoires soulèvent la possibilité que des modifications génétiques compensatoires associées à la perte de α-syn au cours du développement puissent participer à la neuroprotection du MPTP chez les souris nulles α-syn et non à la perte de α-syn en soi.

Il est raisonnable de s'attendre à ce que l'administration chronique d'agonistes β2AR soit nécessaire pour être efficace pour la modification de la maladie de Parkinson. Dans la présente étude, une réduction significative de l'ARNm de Snca chez les rats n'a été observée que dans le paradigme d'injection unique de clenbutérol. De plus, à la dose la plus élevée chez le rat (40 mg/kg), aucun changement dans l'ARNm n'a été observé, suggérant une courbe dose-effet en forme de U inversé avec le clenbutérol aigu. Aucune diminution de l'ARNm de Snca n'a été détectée après plusieurs injections sur une semaine, ce qui suggère une tachyphylaxie associée au clenbutérol. La diminution des niveaux de clenbutérol après une administration répétée rend difficile de déterminer si un agonisme soutenu de β2AR pourrait réduire la protéine α-syn. Il est possible qu'un agoniste β2AR différent qui n'est pas sujet à la tachyphylaxie puisse diminuer l'α-syn. Comme introduit ci-dessus, une stimulation prolongée de β2AR peut entraîner une désensibilisation, une internalisation et une régulation négative des récepteurs. Il a été démontré que des doses de clenbutérol aussi faibles que 0,5 mg/kg deux fois par jour pendant 4 à 7 jours provoquent une désensibilisation fonctionnelle des β2AR corticaux52. Des doses aussi faibles que 0,3 mg/kg deux fois par jour pendant 14 jours et 0,25 mg/kg une fois par jour pendant 10 jours ont entraîné une désensibilisation des récepteurs dans l'aorte et l'utérus du rat, respectivement53,54. Bien que nous n'ayons pas pu observer une diminution de la phosphorylation des β2AR ou de son abondance dans la présente étude, il reste possible qu'une désensibilisation fonctionnelle des β2AR se produise après une administration répétée de clenbutérol. Cela fournit une explication possible de la raison pour laquelle la dose unique était associée à une diminution de l'ARNm α-syn, mais pas au paradigme de dosage répété. Une autre possibilité pour les différents effets sur l'ARNm α-syn observés avec des paradigmes de dosage unique ou multiple est que l'administration répétée de clenbutérol accélère son propre métabolisme. En effet, dans le cerveau et le plasma, nous avons observé des niveaux inférieurs de clenbutérol après le paradigme de l'injection multiple par rapport à l'injection unique. Le clenbutérol est un substrat des enzymes du cytochrome P450 CYP1a1 et CYP1a255, et son administration à des poulets élève le cytochrome microsomique hépatique P45056. Pris ensemble, la nature transitoire de la réduction de l'ARNm de Snca observée avec le paradigme de dosage unique combiné à aucune réduction détectable de la protéine α-syn dans aucun paradigme induit par le clenbutérol, un agoniste β2AR, soulève la question de savoir si les agonistes β2AR apporteraient des avantages à long terme comme un traitement diminuant le risque ou modificateur de la maladie pour la MP.

Un autre concept à considérer est les doses efficaces et toxiques de l'agoniste β2AR. Chez la souris, 10 mg/kg de clenbutérol ont été signalés comme étant nécessaires pour diminuer l'α-syn, et se traduit par environ 20 ng/g de clenbutérol dans le tissu cérébral 24 h après l'injection37. Bien que le clenbutérol ne soit pas approuvé par la FDA pour une utilisation chez l'homme, il est fréquemment pris comme supplément en vente libre pour la perte de poids et la croissance musculaire. Chez l'homme, les doses prises sont de l'ordre de 20 à 100 microgrammes, avec des effets indésirables tels que tachycardie, douleurs thoraciques, palpitations, tremblements et ischémie myocardique rapportés dans certains cas à ces doses57,58,59,60. Dans les modèles de rongeurs, le clenbutérol chronique peut endommager le tissu myocardique61,62. Ces effets secondaires indésirables potentiels associés à des doses relativement faibles peuvent limiter le potentiel thérapeutique du clenbutérol. Une prudence similaire serait recommandée avec l'utilisation d'autres agonistes β2AR à longue durée d'action si l'objectif était d'obtenir des niveaux cérébraux comparables à ce qui serait nécessaire chez la souris pour diminuer l'α-syn.

Notre étude actuelle s'est concentrée sur l'effet du clenbutérol spécifiquement sur la protéine α-syn, cependant, nous ne pouvons pas exclure le potentiel des agonistes β2AR à fournir une neuroprotection et/ou un bénéfice symptomatique dans la MP via d'autres mécanismes. Il a été démontré que les agonistes β2AR dans des modèles animaux augmentent le transport via le grand système d'acides aminés neutres, augmentant le transport de la L-tyrosine pour la synthèse de la dopamine ainsi que de la lévodopa à travers la barrière hémato-encéphalique63,64,65,66,67,68. Il a été rapporté que l'agoniste β2AR couramment utilisé pour l'asthme, l'albutérol, entraînait une amélioration de certains symptômes moteurs de la MP lorsqu'il était utilisé comme traitement d'appoint à la lévodopa63,64. De plus, il a été démontré que les agonistes β2AR ont des propriétés anti-inflammatoires associées à la neuroprotection. Réduction de la molécule adaptatrice de liaison au calcium ionisée 1 (IBA1) et du groupe de marqueurs phagocytaires de la microglie positive de la molécule de différenciation 68 (CD68) en réponse à la roténone69, réduction de l'oxyde nitrique synthase inductible (iNOS) et de l'expression de l'ARNm du groupe de la molécule de différenciation 11B (CD11b) dans l'hippocampe en réponse à l'acide kaïnique70, suppression de la prolifération de la microglie71, réduction du facteur de nécrose tumorale alpha (TNF-α) et de l'interleukine 6 (IL-6) en réponse aux lipopolysaccharides (LPS)72,73, réduction du TNF-α et de l'oxyde nitrique de la microglie et la neuroprotection du LPS ont toutes été rapportées48. Il a également été démontré que les agonistes β2AR augmentent les facteurs neurotrophiques, tels que le facteur de croissance nerveuse et le facteur neurotrophique dérivé du cerveau70,74,75. En plus des modèles de MP, il a été rapporté que les agonistes β2AR sont neuroprotecteurs dans les modèles précliniques d'AVC ischémique76 et d'excitotoxicité70, favorisent la neurogenèse, la ramification dendritique et diminuent les plaques amyloïdes cérébrales dans le modèle Alzheimer de souris transgénique APP/PS1, et produisent des avantages moteurs dans le Modèle de souris SLA transgénique SOD1G93A77.

En conclusion, nos résultats in vivo actuels chez deux espèces et les résultats in vitro, menés dans deux laboratoires distincts, démontrent que la capacité du clenbutérol à réduire l'α-syn est transitoire et limitée à des diminutions modestes de l'ARNm α-syn mais pas des protéines. Nos résultats démontrent que ces effets minimes sont perdus avec une administration répétée, peut-être en raison de la désensibilisation des récepteurs β2AR et/ou de l'augmentation du métabolisme des médicaments. Sur la base de ces résultats, nous concluons que le clenbutérol, agoniste des β2AR en soi, n'a pas le potentiel de réduire l'α-syn en tant que stratégie de modification de la maladie pour la MP.

Des rats mâles Fischer 344 (n = 90) âgés de trois mois ont été achetés chez Charles River Laboratories; Des souris mâles C57BL/6 J âgées de huit semaines (n = 40) ont été achetées au Jackson Laboratory. Les rats ont été logés 1 à 3 par cage et les souris ont été logées 5 par cage dans une pièce sur un cycle lumière / obscurité de 12 h, et de la nourriture et de l'eau ont été fournies à volonté. Tous les travaux sur les animaux ont été effectués dans le vivarium du Michigan State University Grand Rapids Michigan State Research Center. Toutes les procédures ont été approuvées et menées conformément au comité de l'Institut de protection et d'utilisation des animaux de l'Université de l'État du Michigan (IACUC) de l'Université de l'État du Michigan.

La poudre de Clenbuterol HCl (Sigma-Aldrich C5423; Lot # BCBQ2163V) a été stockée à 4 ° C avant utilisation. Environ 30 à 60 minutes avant les injections, le clenbutérol a été dilué dans une solution saline stérile à 0,9 % à une concentration de 5 mg/mL basée sur la base libre, puis vortexé jusqu'à ce qu'il soit complètement en solution. Les animaux ont été pesés, puis ont reçu une injection intrapéritonéale (ip) ou sous-cutanée (sc) de la quantité appropriée de solution en fonction du poids pour délivrer 10, 20 ou 40 mg/kg de clenbutérol. Les groupes témoins de véhicules ont reçu une solution saline à 0,9 % en poids à un volume égal au volume le plus élevé délivré à l'espèce : souris (10 mg/kg) ou rats (40 mg/kg). Dans les études à doses multiples, les injections ont été effectuées tous les deux jours, profitant de la demi-vie d'environ 30 h41 pour maintenir les niveaux de clenbutérol présents tout le temps. Toutes les pesées et injections ont été effectuées le matin, les animaux étant euthanasiés et les tissus/plasma prélevés le lendemain de la dernière injection.

Les animaux ont été euthanasiés avec une surdose de pentobarbital (Beuthanasie-D Special, Merck Animal Health) (30 mg/kg). Pour collecter le LCR, les rats ont été fixés dans un instrument stéréotaxique modifié pour contenir un jeu de veines du cuir chevelu papillon (Exel International, 26708). L'aiguille a été abaissée dans la citerne magna, le LCR extrait et stocké pendant une courte période sur de la glace. Le LCR a été centrifugé (10 000 × g pendant 10 min à 4 ° C) pour éliminer les traces de sang, puis stocké à -80 ° C. Pour collecter le plasma, le sang cardiaque a été extrait avec une seringue héparinée, transféré dans un tube de prélèvement sanguin BD Vacutainer™ (BD 367862), inversé pour mélanger et conservé sur de la glace jusqu'à ce que les échantillons puissent être traités. Le sang a été centrifugé (3 000 tr/min pendant 5 min à 4 °C), le plasma a été prélevé et conservé à -80 °C. Immédiatement après la collecte de sang cardiaque, les rats ont été perfusés par voie intracardiaque et les souris ont été perfusées par voie transcardiaque avec une solution saline héparinée glacée (0, 9%) pour éliminer le sang du cerveau qui pourrait compliquer les résultats. Les cerveaux ont été prélevés et congelés rapidement dans du 2-méthylbutane sur de la neige carbonique, puis stockés à -80 ° C. Les cerveaux ont été montés et sectionnés dans les régions d'intérêt sur un cryostat à -15 ° C, puis les régions d'intérêt (striatum, substantia nigra, hippocampe) ont été microdisséquées et collectées dans des tubes de microcentrifugeuse. Les tissus collectés pour les transferts Western, les ELISA et la spectrométrie de masse ont été conservés sur de la neige carbonique puis stockés à -80 ° C. Le tissu recueilli pour la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR) a été ajouté à des tubes de microcentrifugeuse sans DNase/RNase contenant 100 µL de réactif TRIzol (Invitrogen 26696026), homogénéisé avec un pilon jetable, le volume de réactif TRIzol a été porté à 1 mL, mélangé par pipetage, congelé sur de la neige carbonique et stocké à -80 ° C.

Les échantillons dans TRIzol ont été décongelés sur de la glace et brièvement centrifugés pour recueillir tout le liquide au fond du tube. Des tubes de microcentrifugeuse Phasemaker (Invitrogen, A33248) ont été préparés par centrifugation pendant 30 s à 16 000 × g. Chaque échantillon a été transféré dans un tube Phasemaker et incubé à température ambiante pendant 5 min, suivi de l'ajout de 200 µL de chloroforme. Les tubes ont été secoués à la main, incubés à température ambiante pendant 10 min et centrifugés pendant 5 min à 16 000 × g à 4 ° C. La phase aqueuse (liquide clair) a été transférée dans un tube exempt de RNase, un volume égal d'éthanol à 100 % a été ajouté et les échantillons ont été brièvement vortexés. Un kit de purification d'acide nucléique sur colonne (Zymo Research, R1016) a été utilisé pour traiter davantage les échantillons avec des méthodes modifiées par rapport aux instructions du fabricant. L'échantillon a été ajouté 600 µL à la fois à la colonne et centrifugé pendant 1 min à 12 000 × g, ceci a été répété jusqu'à ce que l'échantillon entier soit utilisé. Toutes les étapes de tampon de lavage/préparation d'ARN ont été effectuées en ajoutant le tampon à la colonne et en centrifugant pendant 1 min à 12 000 × g. Une fois les échantillons chargés sur les colonnes, les échantillons ont été lavés avec 400 µL de tampon de lavage d'ARN. Un cocktail 1X DNase I (DNase I de Thermo Scientific FEREN0521 ; tampon de réaction avec MgCl2 de Thermo Scientific FERB43) a été ajouté à la colonne, incubé pendant 15 min à température ambiante. Après avoir centrifugé le cocktail de DNase I à travers la colonne, 400 µL de tampon de préparation d'ARN ont été ajoutés et passés à travers la colonne. Les colonnes ont été lavées avec du tampon de lavage d'ARN deux fois, 700 µL puis 400 µL respectivement, puis séchées pendant 2 min à 12 000 × g. De l'eau sans DNase/RNase (15 µL) a été ajoutée, les colonnes ont été incubées pendant 1 min à température ambiante et l'ARN a été élué par centrifugation (1 min à 10 000 × g). La qualité et la quantité d'ARN ont été évaluées avec un bioanalyseur Agilent 2100 utilisant un kit Agilent RNA 6000 Pico (5067-1513). Avant de stocker l'ARN à -80 ° C, l'ARN a été dilué à 1 ng / µL avec de l'eau sans DNase / RNase et aliquoté.

L'ARN a été décongelé et 2 ng ont été utilisés avec iScript Reverse Transcription Supermix pour la synthèse d'ADNc (Bio-Rad, 1708841). La synthèse d'ADNc a été réalisée dans un thermocycleur avec les réglages suivants : 5 min à 25 °C, 20 min à 46 °C, 1 min à 95 °C, maintien à 4 °C (température constante du couvercle de 105 °C). Dans le cas où un stockage à -20 ° C était nécessaire, tout l'ADNc a été dilué avec un tampon de stockage d'ADNc 2X (parties égales Tris HCl 10 mM (pH 7, 5) et EDTA 0, 1 mM pH (8, 0)). Pour préparer des échantillons pour la PCR numérique en gouttelettes (ddPCR), l'ADNc a été décongelé si nécessaire sur de la glace et un mélange maître contenant 2X ddPCR Supermix for Probes (Bio-Rad, 186-3026) et les ensembles de sondes d'amorces 20X Taqman ont été fabriqués. Les sondes utilisées pour les souris étaient Snca (Applied Biosystems #4331182, Mm01188700_m1, FAM-MGB); et deux sondes de référence différentes, Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Mm99999915_g1, VIC-MGB) et Rpl13 (Applied Biosystems #4331182, Mm02342646_g1, VIC-MGB). Les résultats normalisés à Rpl13 peuvent être trouvés dans la Fig. 8 supplémentaire. Les sondes utilisées pour les rats étaient Snca (Applied Biosystems #4331182, Rn00569821_m1, FAM-MGB) et la sonde de référence était Gapdh (Applied Biosystems #4331182, Rn01749022_g1, VIC-MGB). Pour tous les ensembles de sondes d'amorce Taqman utilisés, la sonde s'étendait sur une jonction exon-exon. Des parties égales d'ADNc et de mélange maître ont été ajoutées aux tubes, mélangées, brièvement centrifugées et 20 µL ajoutés aux puits d'échantillon des cartouches de générateur de gouttelettes DG8 (Bio-Rad, 1864008). Aux puits de pétrole de la cartouche, 70 µL d'huile de génération de gouttelettes (Bio-Rad, 1863005) ont été ajoutés. Un joint en caoutchouc (Bio-Rad, 1863009) a été fixé sur la cartouche et un générateur de gouttelettes QX (Bio-Rad, 186-4002) a été utilisé pour produire des gouttelettes contenant de l'ARN. Du puits à gouttelettes de la cartouche, 40 µL de gouttelettes sont transférées dans une plaque à 96 puits (Bio-Rad, 12001925). Lorsque tous les échantillons sont transférés, la plaque a été scellée avec une feuille perçable (Bio-Rad, 181-4040) par un scellant de plaque (Bio-Rad, 181-4000). Les plaques ont été transférées dans un thermocycleur (Bio-Rad, C1000), avec les réglages suivants : 10 min à 95 °C, 39 cycles (30 s à 94 °C, 1 min à 60 °C), 10 min à 98 °C , maintenir à 12 °C (température constante du couvercle de 105 °C). Après la PCR, les plaques sont transférées sur le lecteur de gouttelettes QX200 (Bio-Rad, 1864003) et les résultats analysés avec le logiciel QuantaSoft. Pour tous les échantillons, le gène d'intérêt a été normalisé par rapport au gène de référence. Gapdh a été choisi comme l'un des gènes de référence car il s'agit d'un gène et d'une protéine domestiques utilisés de manière conventionnelle et montre une expression d'ARNm élevée et cohérente dans la plupart des tissus. Un gène de référence supplémentaire, Rpl13a, a également été utilisé car le gène apparenté Rpl13 a été utilisé dans Mittal et al.37, qui ont initialement signalé les effets du clenbutérol sur l'ARNm Snca et la protéine α-syn. L'utilisation de différents gènes de référence pour la normalisation n'a pas affecté les résultats globaux.

La préparation de l'échantillon pour examiner la protéine α-syn a été réalisée en deux étapes, une première lyse faible comme effectuée dans Mittal et al.37, et une deuxième étape de lyse forte sur le culot restant. Des poinçons de tissus congelés retirés de −80 °C, 100 µL et 200 µL de tampon de lyse faible (saccharose 320 mM, NaF 5 mM, Na3VO4 1 mM, Tris 10 mM (pH 7,4), EGTA 1 mM, EDTA 1 mM) ont été ajouté respectivement au SN et au striatum. Le tissu a été homogénéisé avec un pilon jetable, incubé sur de la glace pendant 10 min et centrifugé pendant 10 min à 10 000 × g à 4 °C. Le surnageant a été transféré dans un nouveau tube et centrifugé à nouveau pendant 10 min à 10 000 × g à 4 ° C, et le surnageant a été collecté, avec seulement un petit culot restant, le cas échéant. Un tampon de lyse RIPA (Santa Cruz Biotechnology, sc-24948) égal à la quantité initiale de tampon de lyse faible a été ajouté au culot restant de la centrifugation initiale de la fraction de lyse faible. Le culot dans le tampon RIPA a été homogénéisé avec 2 à 4 salves d'un sonicateur à sonde (Qsonica Q125), sonde de 2 mm de diamètre (QSonica. 4423), impulsions de 1 s à une amplitude réglée à 30 %. Les échantillons dans le tampon RIPA ont été centrifugés pendant 10 min à 10 000 × g à 4 ° C et le surnageant a été collecté, bien que peu ou pas de culot soit présent. Un test d'acide bicinchoninique (BCA) (Fisher, 23223, acide bicinchoninique; Fisher, 23224, sulfate de cuivre) a été utilisé pour estimer la quantité de protéines dans les fractions de tampon de lyse faible et forte (RIPA) avant stockage à -80 ° C.

Un tampon d'échantillon 3X a été préparé (140 µl 50 % glycérol/0,1 bleu de bromophénol, 40 µl 10 % SDS et 20 µl bêta-mercaptoéthanol) et ajouté à 5 à 10 µg de protéines de chaque échantillon. Les échantillons ont été incubés à 100 °C pendant 5 min, refroidis sur de la glace, brièvement mélangés et centrifugés, puis chargés sur un gel prémoulé Criterion TGX 26 puits à 4 – 20 % (Bio-Rad, 5671095) dans un tampon de migration (base Trizma à 3,03 %, 14,4 % glycine, 1 % SDS). Une échelle Precision Plus Protein Dual Xtra (Bio-Rad, 161-0377) a été utilisée car la gamme de marqueurs de protéines recombinantes (2–250 kD) comprenait des marqueurs d'environ 14 kD, où α-syn devrait être présent. Les gels ont été exécutés à tension constante, en commençant à 90 V pendant 45 min, puis à 130 V jusqu'à ce que le front de colorant ait presque disparu du gel. Avant la fin de l'exécution du gel, les membranes ont été préparées pour le transfert. Pour les α-syn blots, une membrane de nitrocellulose de 0,45 µm (Bio-Rad, 1620167) et du papier buvard (Bio-Rad, 1620118) ont été trempés pendant au moins 5 min dans un tampon de transfert (3,03 % de base Trizma, 14,4 % de glycine, 20 % méthanol). Pour toutes les autres protéines, une membrane Immobilon-FL (Millipore, IPFL00010) a été activée pendant 30 s dans du méthanol à 100 %, puis trempée dans du tampon de transfert à la place de la membrane de nitrocellulose. Un transfert humide a été exécuté à courant constant, 400 mA, pendant 45 min. Immédiatement après la fin du transfert, les membranes ont été retirées et uniquement dans le cas des transferts α-syn, fixées dans du paraformaldéhyde à 0, 4% dans une solution saline tamponnée au tris 1X (TBS) (pH 7, 4) pendant 30 min. Les membranes ont été lavées 2 × 5 min avec du TBS. Les membranes ont été incubées dans Revert Protein Dye (LI-COR 926-11021) pendant 5 min, lavées 2 × 30 s avec une solution de 6,7 % d'acide acétique glacial et 30 % de méthanol, rincées avec ddH2O et imagées à 700 nm sur un LI -COR Odyssey CLx pour les protéines totales. Les membranes ont été retirées, lavées 2 × 5 min avec du TBS et bloquées pendant 1 h dans un tampon de blocage TBS-Tween (0, 1%): StaringBlock T20 (Thermo Scientific, 37543) 1: 1. Les membranes ont été incubées dans un anticorps primaire dans un tampon de blocage TBS-Tween (0, 1%): StaringBlock T20 1: 1 pendant une nuit à 4 ° C. Les anticorps primaires utilisés étaient : 1:1 000 lapin anti-α-syn (Abcam, ab212184, Lot#GR3185934), 1:500 souris anti-α-syn (Millipore, MABN1817, Lot#3099686), 1:500 rat anti-DAT (Millipore, MAB369, Lot#3258730), 1:1 000 lapin anti-DAT (Sigma-Aldrich, D6944, Lot#087M4786V), 1:1 000 lapin anti-β2AR (Invitrogen, MA5-32570, Lot#UH2832117), 1 : 500 lapins anti-β2AR phosphorylés à la sérine 355 (Invitrogen, PA5-38403, Lot #UI2847382) et 1:500 lapins anti-β2AR phosphorylés à la sérine 346 (Invitrogen, PA5-36784, Lot #UH2832047). Les membranes ont été lavées 3 x 5 min avec du TBS-Tween (0, 1 %) et incubées dans un anticorps secondaire pendant 1 h à température ambiante dans l'obscurité. Les anticorps secondaires utilisés étaient : 1:15 000 âne anti-lapin IRDye 800CW (LI-COR, 926-32213, Lot#C60322-03), 1:15 000 chèvre anti-souris IRDye 800CW (LI-COR, 926-32210, Lot# C20808-02), ou 1:15 000 chèvre anti-rat IRDye 800CW (LI-COR, 926-32219, Lot #C90813-13). Les membranes ont été conservées dans l'obscurité et lavées 3 × 5 min avec du TBS-Tween (0, 1%), 1 × 5 min dans du TBS, et imagées sur un LI-COR Odyssey CLx pour la protéine d'intérêt. La densitométrie de bande a été réalisée à l'aide de LI-COR Image Studio Lite (version 5.2). Des boîtes ont été dessinées autour de la tache de protéine totale et de la bande cible correspondante pour obtenir le signal de protéine totale et le signal de bande cible dans chaque voie. Les signaux de chaque voie de tache de protéine totale ont été divisés par le signal de voie de tache de protéine totale le plus élevé pour calculer le facteur de normalisation de voie pour chaque voie. Le signal normalisé pour chaque échantillon a été calculé en divisant le signal de bande cible par le facteur de normalisation de voie correspondant. Des exemples de voies pleine longueur représentatives de western blot (contrôle de charge de protéine totale et protéine cible) sont présentés dans les figures supplémentaires. 9 et 10.

Les ELISA ont été réalisées à l'aide d'un kit ELISA sandwich colorimétrique souris α-syn préfabriqué (LS Bio, LS-F6284-1) en suivant les instructions du fabricant. Les échantillons ont été dilués au 1/20 pour le SN, au 1/20 pour le striatum et au 1/25 pour le plasma dans un diluant d'échantillon. Les étalons et les échantillons ont été analysés en double. Un test BCA a été effectué en utilisant les échantillons dilués restants du SN et du striatum, et utilisé pour normaliser les résultats aux protéines. L'absorbance à 450 nm a été lue avec un lecteur multimode hybride Synergy H1.

Des coupes de tissu cérébral coronal de quarante micromètres d'épaisseur ont été lavées dans du TBS avec du Triton X-100 (TBS-TX) et incubées dans du peroxyde d'hydrogène du kit de prétraitement RNAscope (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322330) pendant 1 h. Les sections ont été lavées dans du TBS puis montées sur des lames VistaVision HistoBond (VWR, Randor, PA; 16004-406) et placées sur un chauffe-lame à 60 ° C pendant la nuit. Les lames ont ensuite été incubées pendant 10 min dans un tampon de récupération de cible ACD Biosciences à 99 ° C, puis lavées deux fois dans de l'eau. Le tissu a été décrit avec Pap Pen (Abcam, Cambridge, Royaume-Uni; ab2601), incubé avec la protéase ACD plus dans un four d'hybridation à 40 ° C pendant 15 min, lavé deux fois dans l'eau et incubé avec la sonde pour rat Adrb2 (Cat No: 468131, Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA ; 457731) pendant 2 h dans le four d'hybridation à 40 °C, suivi de lavages dans du tampon de lavage ACD. Six étapes d'amplification avec les tampons d'amplification (Advanced Cell Diagnostics, Hayward, CA; 322300) ont ensuite été effectuées en alternant des intervalles d'incubation de 30 et 15 minutes dans le four d'hybridation selon les instructions du fabricant. Le tissu a été développé à l'aide du réactif DAB fourni, lavé dans du TBS-TX, soumis à des lavages ascendants à l'éthanol et clarifié avec des xylènes. Les lames ont été recouvertes de Cytoseal 60 et imagées avec un microscope Nikon Eclipse 90i avec une caméra QICAM (QImaging, Surrey, Colombie-Britannique, Canada).

Tous les solvants étaient de qualité LC-MS et achetés chez Fisher Scientific. Tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Les filtres Spin ont été achetés chez Millipore Sigma. 100 μL de plasma de rat et 50 μL de plasma de souris ont été utilisés par échantillon. Le plasma a été précipité avec de l'acétone glacée 4: 1 à -20 ° C pendant la nuit. Après centrifugation (18 000 × g, 2 min), le surnageant a été retiré et séché jusqu'à la fin (30 ° C à l'aide d'une centrifugeuse sous vide). Les échantillons ont été remis en suspension dans 300 µL d'acide formique à 0,1 %. Les particules insolubles ont été éliminées par filtration avec un filtre centrifuge de coupure de 3 kDa. L'écoulement a été séché jusqu'à la fin et remis en suspension dans 20 μL d'acide formique à 0,1 %, 2 % d'ACN, avec 2,5 ng/mL de clenbutérol-d9 lourd. Des courbes d'étalonnage ont été générées en mélangeant du plasma non traité de 5 animaux (rat ou souris) et en dopant le plasma mélangé avec du clenbutérol à des concentrations de 0,06, 0,2, 0,6, 2,0, 6,0, 20,0, 60,0 et 200,0 ng/mL. Toutes les expériences ont été menées sur un spectromètre de masse hybride Quadripôle-Orbitrap™ Thermo Scientific™ Q Exactive™ HF-X avec un système UHPLC Thermo Scientific™ UltiMate™ 3000. Chaque analyse consiste en trois gradients en phase inverse de 15 minutes avec des injections d'échantillon de 2 µl. Les séparations utilisent une colonne C18 EasySpray de 15 cm. Les échantillons sont chargés sur une cartouche de piège C18 de 5 mm pour un dessalage en ligne avant la séparation chromatographique. Les échantillons ont été acquis en triple exemplaire.

L'analyse par spectrométrie de masse a utilisé le mode de balayage PRM pour isoler et fragmenter le clenbutérol (277,08690 m/z) et le clenbutérol lourd (286,14339 m/z). Les spectres de masse des fragments ont été acquis à une résolution de 15 000 (200 m/z), avec un AGC de 2e5 et un temps d'injection maximum de 100 ms. Les peptides ont été fragmentés avec une collision étagée NCE 25, 50 et une fenêtre d'isolement de 1,3 m/z. La tension d'électropulvérisation était de 1,9 kV. La sélection des pics et les calculs de surface ont été effectués par Skyline version 4.2. Tous les pics sont validés manuellement. Les aires de pics additionnées des fragments de clenbutérol 203,01373 m/z, 168,044877 m/z et 132,068199 m/z, normalisées aux aires de pics additionnées des fragments de clenbutérol lourds 204,020006 m/z, 169,051154 m/z et 133,074476 m/z sont utilisées pour la quantification.

Tous les solvants étaient de qualité LC-MS et achetés chez Fisher Scientific. Tous les autres produits chimiques ont été achetés auprès de Sigma-Aldrich. Les filtres Spin ont été achetés chez Millipore Sigma. Des coups de poing de 5 à 10 mg de tissu cérébral ont été séquestrés en fractions «liées» et «non liées». Les fractions "liées" représentent le clenbutérol lié aux protéines, comme l'interaction avec β2AR. La préparation des fractions "totale", "non liée" et "liée" pour chaque échantillon est la suivante. Toutes les manipulations ont été réalisées sur glace. Les échantillons ont été lysés par sonication pendant 10 s dans 200 μL de bicarbonate d'ammonium 25 mM (AMBIC), pH 8. 10 μL de surnageant ont été retirés en tant que représentation du clenbutérol "total" et mis de côté. Les échantillons ont été centrifugés (18 K × G, 10 min). Le surnageant restant a été filtré par centrifugation (3 kDa 18 K × G, 10 min) sans rinçage. L'écoulement a été recueilli sous forme de fractions "non liées". Le matériau retenu sur le filtre a été recueilli par centrifugation inversée (18 K × G, 2 min) sous forme de fractions "liées". Le matériel cérébral en granulés a été extrait avec 200 μL d'ACN 60%, MeOH 30%, AMBIC 10% 25 mM, pH 8, soniqué pendant 10 s et centrifugé (18 K × G, 10 min). Le surnageant a été retiré et combiné avec les fractions "liées". Les protéines des fractions "totale", "non liée" et "liée" ont été précipitées avec de l'acétone glacée 5: 1 à -20 ° C pendant la nuit. Après centrifugation (18 K × G, 10 min), le surnageant a été retiré et séché jusqu'à la fin (30 ° C à l'aide d'une centrifugeuse sous vide). Les fractions « non liées » ont été remises en suspension dans 20 μL de FA à 0,1 %, ACN à 2 %, avec 2,5 ng/mL de clenbutérol lourd-d9. Les fractions "liées" ont été remises en suspension dans 20 μL de FA à 0,1 %, d'ACN à 2 %, avec 2,5 ng/mL de clenbutérol-d9 lourd. 180 μL de FA à 0,1% ont été ajoutés, filtrés par centrifugation, séchés jusqu'à la fin et remis en suspension dans 20 μL de FA à 0,1%, 2% d'ACN.

Les fractions « totales » ont été remises en suspension dans 200 μL d'acide formique à 0,1 %, filtrées par centrifugation, séchées jusqu'à la fin et remises en suspension dans 20 μL de FA à 0,1 %, 2 % d'ACN, avec 2,5 ng/mL de clenbutérol lourd-d9. Des courbes d'étalonnage "non liées" et "liées" ont été générées en combinant 10 mg de tissu cérébral non traité de 10 souris, en les sonifiant dans 2 ml de tampon, en aliquotant le lysat dans dix échantillons et en retirant 10 μL de chaque aliquote. Les aliquotes ont été séparées en fractions « non liées » et « liées » par filtration centrifuge comme décrit ci-dessus. Chaque fraction a ensuite été additionnée de clenbutérol à des concentrations de 0,3, 1,0, 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg, 1,0, 3,0 et 10,0 ng. Le clenbutérol a été extrait comme décrit ci-dessus.

La courbe d'étalonnage "Total" a été générée en combinant 10 mg de tissu cérébral non traité de huit souris, en les sonifiant dans 1,6 mL de tampon, en aliquotant le lysat dans 8 échantillons et en ajoutant du clenbutérol à des concentrations de 3,0, 10,0, 30,0, 100,0, 300,0 pg, 1,0, 3,0 et 10,0 ng.

L'analyse statistique a été effectuée à l'aide de GraphPad Prism version 7.03, et la signification pour tous les cas a été effectuée à l'aide de α ≤ 0,05. Les valeurs aberrantes ont été évaluées à l'aide de l'écart absolu par rapport à la méthode médiane78, avec une différence « très conservatrice » de 2,5 X l'écart absolu médian utilisé comme critère d'exclusion. Les expériences avec deux groupes (c'est-à-dire le contrôle salin et le clenbutérol) ont été analysées à l'aide d'un test t bilatéral. Des expériences avec plusieurs groupes à un moment donné (c.-à-d. contrôle salin, 10, 20 et 40 mg/kg de clenbutérol) ont été analysées avec une ANOVA unidirectionnelle et des tests de Tukey post-hoc pour des comparaisons multiples. Les expériences avec plusieurs groupes à 1 jour et 1 semaine ont été analysées avec une ANOVA à deux voies et des tests de Tukey post-hoc pour des comparaisons multiples. L'analyse des changements de poids a été réalisée avec une ANOVA à mesures répétées bidirectionnelles et un test post-hoc de Sidak (souris) ou un test de Tukey (rat) pour des comparaisons multiples. Toutes les moyennes de groupe, les erreurs standard et les informations de test statistique pour tous les résultats se trouvent dans le document de statistiques supplémentaires.

Des neurones corticaux primaires de rat Sprague-Dawley E18 ont été étalés à 50 cellules K par puits dans une plaque revêtue de poly-D-lysine à 96 puits. À DIV11, le véhicule DMSO ou le clenbutérol (concentration finale du puits de 1, 5, 10 ou 20 µM) ont été ajoutés. Deux jours plus tard, à JIV 13, les cellules ont été lavées avec du PBS, puis 175 µL de tampon RLT Plus avec 0,1 % de β-mercaptoéthanol ont été ajoutés à chaque puits. Après avoir combiné 2 puits par échantillon, un kit Qiagen RNeasy Plus Mini couplé à un QiaCube devait extraire l'ARN selon les instructions du fabricant. Pour la synthèse d'ADNc, 16 µL d'ARN ont été ajoutés à 4 µL de 5x iScript RT Supermix (Bio-Rad) et placés dans un thermocycleur (5 min à 25 °C, 30 min à 42 °C, 1 min à 85 °C, maintenir à 4 °C). Multiplex TaqMan RT-qPCR a été utilisé pour quantifier l'expression relative des gènes dans un volume de réaction de 10 uL avec un colorant de référence ROX. Un Snca de rat personnalisé (avant : CTGTACCTGCCCCTCAGCAT ; inverse : AGCCTGCTACCATGTATTCACTGTAG ; sonde : CGGTGCTCCCCTCT) et des ensembles d'amorces/sondes commerciales Xpnpep1 (Applied Biosystems Rn00590960_m1) ont été utilisés. L'amplification de Snca a été normalisée à celle de Xpnpep1. Les valeurs de changement de pli ont été calculées à l'aide de la méthode ΔΔCt et le rapport entre les échantillons traités par le médicament et les témoins a été exprimé. Les données ont été analysées avec l'outil Web cloud Thermo Fisher Connect et Microsoft Excel. Le test de viabilité cellulaire par luminescence CellTiter-Glo (Promega) a été utilisé conformément aux instructions du fabricant pour évaluer la toxicité des traitements.

Les souris C57BL/6 J (n = 24 : dix solution saline et 14 clenbutérol) ont reçu une seule injection ip de 10 mg/kg de clenbutérol ou un volume égal de solution saline témoin. Les animaux ont été euthanasiés 24 h après l'administration, le cerveau retiré et congelés instantanément dans de l'azote liquide. Les cerveaux ont été sectionnés sur un cryostat et des poinçons congelés du SN collectés. Les poinçons de tissu ont été homogénéisés dans du QIAzol à l'aide d'un Omni Bead Disruptor (45 s allumé, 30 s éteint, 45 s allumé). Après 5 min à température ambiante, 200 µL de chloroforme ont été ajoutés et les échantillons ont été vortexés pendant 15 s. Après 3 min à température ambiante, les échantillons ont été centrifugés à 12 000 tr/min pendant 15 min à 4 °C. 400 ul de la couche aqueuse résultante ont été combinés avec un volume égal d'éthanol à 70 % et l'ARN a ensuite été extrait à l'aide du RNeasy Mini Kit (Qiagen) conformément aux instructions du fabricant. La transcription inverse de 300 ng d'ARN a été réalisée dans un volume de réaction de 20 ul à l'aide du kit de synthèse d'ADNc SuperScript VILO (Thermo Fisher). Ce volume de réaction a été dilué à 1:2 avec de l'eau avant de charger 2 uL dans une réaction qPCR de 10 uL contenant 5 uL de TaqMan Gene Expression Master Mix (Thermo Fisher, 4369016) et 0,2 uM de test TaqMan spécifique au gène. Des amorces/sonde TaqMan, identiques à celles utilisées dans Mittal et al37, ont été utilisées pour Snca (Applied Biosystems Mm01188700_m1), qui a été normalisée soit en Rpl13a (Applied Biosystems Mm02342645_g1), Actb (Applied Biosystems Mm00607939_s1) ou Ubc (Applied Biosystems Mm01198 158_m1) . Pour tous les échantillons, le gène d'intérêt a été normalisé au gène de référence ou à la moyenne géométrique des trois gènes de référence. ActB et Ubc ont été sélectionnés en fonction de leur expression stable, de leur utilisation connue en tant que gènes domestiques et de leur utilisation antérieure dans le rapport original sur lequel cette étude est basée37. De même, Rpl13a a également été utilisé car le gène apparenté Rpl13 a été utilisé comme l'un des gènes de référence dans le rapport précédent37. L'utilisation de différents gènes de référence pour la normalisation n'a pas affecté les résultats globaux. Les résultats utilisant des gènes de ménage non présentés dans le manuscrit principal peuvent être trouvés dans la Fig. 8 supplémentaire.

De plus amples informations sur la conception de la recherche sont disponibles dans le résumé des rapports de recherche sur la nature lié à cet article.

Des informations sur les tests statistiques pour tous les résultats peuvent être trouvées dans le document de statistiques supplémentaires. Les données à l'appui des conclusions de cet article sont disponibles sur demande raisonnable de l'auteur correspondant.

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Cette étude a été soutenue par la Fondation Michael J. Fox pour le programme d'avancement des cibles de recherche sur la maladie de Parkinson. Les auteurs tiennent également à remercier le Dr Andrew Koemeter-Cox de la Fondation Michael J. Fox pour la recherche sur la maladie de Parkinson pour sa perspicacité supplémentaire dans le projet et pour avoir facilité les discussions entre les laboratoires.

Département de neurosciences translationnelles, Michigan State University, Grand Rapids, MI, États-Unis

Joseph R. Patterson, Jacob W. Howe, Allyson Cole-Strauss, Christopher J. Kemp, Megan F. Duffy, Jared Lamp, Andrew Umstead, Michael Kubik, Anna C. Stoll, Irving E. Vega, Kathy Steece-Collier & Caryl E. Sortwell

Unité de recherche sur les maladies neurodégénératives, Biogen, Cambridge, MA, États-Unis

Warren D. Hirst, Yi Chen, Anne C. Campbell, Catherine L. Nezich et Kelly E. Glajch

Programme de neurosciences, Michigan State University, East Lansing, MI, États-Unis

Jacob W. Howe, Megan F. Duffy, Michael Kubik et Caryl E. Sortwell

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Christopher P. Russel

Département de pharmacologie et de toxicologie, Michigan State University, East Lansing, MI, États-Unis

Anna C. Stoll

Mercy Health Hauenstein Neuroscience Medical Center, Grand Rapids, MI, États-Unis

Caryl E. Sortwell

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Conceptualisation : JRP, WDH et CES. Enquête : JRP, JWH, CPR, ACS, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN et KEG. Préparation du manuscrit (première ébauche) : JRP et CES. Préparation du manuscrit (révision et édition) : JRP, WDH, CES, JWH, CJK, MFD, JL, AU, MK, ACS, IEV, KSC, YC, ACC, CLN et KEG.

Correspondance à Joseph R. Patterson.

WDH, YC, ACC, CLN et KEG sont des employés de Biogen Inc. Les auteurs ne déclarent aucun autre intérêt concurrent.

Note de l'éditeur Springer Nature reste neutre en ce qui concerne les revendications juridictionnelles dans les cartes publiées et les affiliations institutionnelles.

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Réimpressions et autorisations

Patterson, JR, Hirst, WD, Howe, JW et al. Le clenbutérol, agoniste des récepteurs bêta2-adrénergiques, produit des diminutions transitoires de l'ARNm de l'alpha-synucléine, mais aucune réduction à long terme des protéines. npj Parkinson Dis. 8, 61 (2022). https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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Reçu : 24 décembre 2021

Accepté : 08 avril 2022

Publié: 24 mai 2022

DOI : https://doi.org/10.1038/s41531-022-00322-x

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