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Sep 29, 2023

Isolement et caractérisation des bactériophages du sol contre la détérioration des aliments et les bactéries pathogènes d'origine alimentaire

Rapports scientifiques volume 13,

Rapports scientifiques volume 13, Numéro d'article : 9282 (2023) Citer cet article

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La détérioration microbienne des aliments et les maladies d'origine alimentaire sont les principaux défis de l'industrie alimentaire en ce qui concerne la durée de conservation des aliments. Les méthodes de conservation actuelles sont fréquemment associées à des modifications des caractéristiques organoleptiques et à la perte de nutriments. Pour cette raison, le bactériophage offre une méthode naturelle alternative en tant qu'agent de biocontrôle qui peut réduire la contamination bactérienne dans les aliments sans altérer les propriétés organoleptiques. Cette étude a été menée pour isoler et caractériser les bactériophages du sol afin de contrôler les bactéries d'altération des aliments, telles que Bacillus cereus et Bacillus subtilis, et les bactéries pathogènes d'origine alimentaire, telles que Escherichia coli entérotoxinogène (ETEC) et E. coli entérohémorragique (EHEC). L'isolement a été effectué par la méthode de test de superposition d'agar et les phages BC-S1, BS-S2, ETEC-S3 et EHEC-S4 ont été récupérés. La gamme d'hôtes de tous les phages isolés avait tendance à être étroite et avait une spécificité élevée envers les bactéries spécifiques. L'efficacité du phage a été mesurée là où ETEC-S3 n'a montré aucune efficacité contre B. cereus et EHEC-S4 a montré une faible efficacité contre E. coli entéropathogène (EPEC). L'analyse morphologique a été réalisée pour les phages BC-S1 et ETEC-S3 par microscopie électronique à transmission (TEM), et il s'avère qu'il appartient à l'ordre des Caudovirales. Les phages BC-S1 et BS-S2 ont considérablement réduit les bactéries hôtes lorsqu'ils ont été appliqués sur des échantillons de riz cuit et de lait pasteurisé avec un miMOI de 0,1. Alors que le phage ETEC-S3 à miMOI de 0,001 et le phage EHEC-S4 à miMOI de 1 ont également montré une réduction significative lorsqu'ils sont appliqués à des échantillons de viande de poulet et de laitue à des températures de stockage de 4 ° C et 28 ° C. La réduction bactérienne la plus élevée de 100 % a été démontrée par le phage BC-S1 sur des échantillons de lait pasteurisé et une réduction jusqu'à 96,06 % par le phage ETEC-S3 sur des échantillons de viande de poulet à 28 °C d'incubation.

La contamination microbienne des aliments est une préoccupation majeure dans l'industrie alimentaire. Les aliments contaminés peuvent contenir une variété de microbes, y compris des bactéries qui peuvent utiliser les aliments comme source d'énergie, ne causant ni détérioration des aliments ni maladie d'origine alimentaire1. La détérioration des aliments peut entraîner toute modification des caractéristiques sensorielles d'un produit qui rend les aliments indésirables à la consommation. Une grande variété de sous-produits métaboliques qui provoquent des changements d'odeur, de saveur, de couleur et de texture peuvent entraîner une perte de nourriture, entraînant des effets économiques et environnementaux considérables2. Bacille sp. groupes, tels que Bacillus cereus et Bacillus subtilis sont des bactéries sporulées dont les spores peuvent survivre à la température de traitement élevée. Communément trouvé dans de nombreux aliments gâtés, tels que la filasse dans le pain, la formation de boue dans le riz, ainsi que la mauvaise odeur dans le lait3,4. Bien que les aliments avariés puissent être consommés sans danger, certaines bactéries peuvent avoir une pathogénicité pouvant entraîner des maladies d'origine alimentaire. L'un des principaux agents pathogènes impliqués dans les maladies diarrhéiques, qui peuvent également entraîner la mort, est l'Escherichia coli diarrhéique (DEC) qui peut être trouvé dans le sol et l'eau, comme l'ETEC et l'EHEC5.

De nombreux facteurs de risque associés à la contamination bactérienne des aliments sont souvent liés à leurs pratiques de transformation, de préparation, de stockage et de manipulation. Les méthodes conventionnelles de conservation des aliments, telles que la pasteurisation, le traitement à haute pression, l'irradiation et les agents chimiques ou biologiques, sont couramment utilisées pour aider à améliorer la sécurité alimentaire. Cependant, ces traitements sont fréquemment associés à des modifications des caractéristiques organoleptiques, à une perte de nutriments, ainsi qu'à des effets secondaires potentiellement toxiques6,7. De plus, même avec la variété des méthodes disponibles, les épidémies d'origine alimentaire se produisent encore relativement souvent8. Pour cette raison, il est nécessaire de trouver une méthode de conservation alternative pour contrôler la détérioration des aliments.

Une technique prometteuse et sûre qui comble plusieurs lacunes est le contrôle biologique des bactériophages. Cette méthode utilise des bactériophages lytiques pour cibler spécifiquement les bactéries pathogènes et éliminer ou réduire considérablement leurs niveaux dans les aliments afin d'améliorer la sécurité des produits alimentaires. Les bactériophages sont des virus qui lysent les hôtes bactériens vivants. Ce potentiel lytique a été exploité dans des tentatives de conception d'une approche antimicrobienne plus naturelle pour contrôler les bactéries aux différentes étapes de la production alimentaire9. Ils sont très spécifiques à l'hôte, sûrs à consommer, relativement peu coûteux et n'altèrent pas les propriétés organoleptiques des aliments10. On les trouve presque partout où existent des bactéries vivantes, comme le sol, offrant la possibilité de les isoler à des fins thérapeutiques. Par conséquent, l'utilisation de bactériophages comme alternative de conservation naturelle est très prometteuse6,11. Sur la base de ces antécédents, cette étude visait à isoler et à caractériser les bactériophages du sol dans le contrôle de la détérioration des aliments et des bactéries pathogènes d'origine alimentaire, telles que B. cereus, B. subtilis, ETEC et EHEC.

Bacillus cereus phage S1 (BC-S1), Bacillus subtilis phage S2 (BS-S2), ETEC phage S3 (ETEC-S3) et EHEC phage S4 (EHEC-S4) ont été isolés de différents échantillons de sol à proximité de l'élimination des déchets organiques. Les plaques claires formées à la suite de l'essai de recouvrement d'agar ont indiqué la lyse des bactéries par le phage. La concentration des bactériophages isolés a été mesurée par détermination du titre. Le phage BC-S1 a obtenu le titre le plus élevé avec la valeur de 1,72 ± 0,31 × 1010 PFU/mL comparé au phage BS-S2 1,57 ± 0,92 × 109 PFU/mL, le phage ETEC-S3 8,24 ± 1,38 × 109 PFU/mL, et aussi avec phage EHEC-S4 avec la valeur de 1,26 ± 0,86 × 105 PFU/mL.

La gamme d'hôtes des bactériophages isolés a été déterminée à l'aide de B. cereus, B. subtilis, ETEC, EHEC, EPEC et Vibrio cholerae. La gamme d'hôtes des bactériophages isolés a été présentée dans le tableau 1. Outre leur capacité à lyser sa cellule hôte, le phage ETEC-S3 a également montré une activité lytique contre B. cereus et le phage EHEC-S4 a montré une activité lytique contre EPEC. Alors que le phage BC-S1 et le phage BS-S2 ont montré qu'ils ne pouvaient lyser que leur hôte lui-même. Ils ont réalisé une spécificité d'hôte élevée qui ne pouvait pas attaquer d'autres bactéries, même appartenant au même genre.

Tous les phages isolés ont montré une activité uniquement en infectant des bactéries spécifiques, leur hôte bactérien. Cependant, le phage ETEC-S3 s'est également avéré attaquer de manière inefficace B. cereus avec une EOP inférieure à 0, 001, tandis que le phage EHEC-S4 avait également une faible efficacité avec une EOP de 0, 001 à 0, 2 contre l'EPEC (tableau 2).

La MOI du bactériophage a été réalisée sur huit concentrations différentes de 102 à 10–5. Le contrôle positif n'a montré que des bactéries hôtes sans ajouter de bactériophages, tandis que le contrôle négatif n'a montré que des bactériophages sans ajouter les bactéries hôtes. Sur la base du résultat, l'inhibition la plus élevée pour le phage BC-S1 (Fig. 1) et le phage BS-S2 (Fig. 2) a été montrée pour MOI 0,1. Alors que ETEC-S3, MOI 0,01 au MOI 100 le plus élevé peut inhiber ETEC sans croissance au cours des 6 premières heures d'incubation, suivie d'une re-croissance d'ETEC. Par conséquent, le miMOI du phage ETEC-S3 était de 0, 001, alors que le graphique ne montrait aucune croissance bactérienne d'ETEC (Fig. 3). miMOI du phage EHEC-S4 était de 1, ce qui pouvait inhiber la croissance d'EHEC dans les 10 h d'incubation. La croissance bactérienne a diminué à mesure que le MOI augmentait (Fig. 4).

miMOI du bactériophage BC-S1.

miMOI du bactériophage BS-S2.

miMOI du bactériophage ETEC-S3.

miMOI du bactériophage EHEC-S4.

Le bactériophage BC-S1 et le phage ETEC-S3 ont été poursuivis pour la détermination de la morphologie en raison de leurs activités plus élevées en utilisant la microscopie électronique à transmission (TEM) comme le montre la Fig. 5. Le phage BC-S1 a réalisé une tête icosaédrique d'environ 75 nm de diamètre et d'environ 90 nm. queue contractile. Alors que le phage ETEC-S3 a réalisé une tête icosaédrique avec un diamètre d'environ 65 nm et une queue contractile d'environ 100 nm.

Morphologie des bactériophages avec TEM (a, BC-S1 ; b, ETEC-S3).

Chaque bactériophage a été testé pour sa capacité à réduire le nombre de bactéries pathogènes spécifiques sur des échantillons alimentaires. Les phages BC-S1 et BS-S2 ont été appliqués sur du riz cuit et du lait pasteurisé, tandis que les phages ETEC-S3 et EHEC-S4 ont été appliqués sur de la viande de poulet et de la laitue pour voir l'effet de leur application sur différentes matrices et surfaces alimentaires. L'incubation a été effectuée pendant une nuit à température de stockage réfrigéré (4°C) et à température ambiante (28°C). Les résultats ont été présentés dans le tableau 3, où tous les bactériophages isolés ont montré une réduction dans tous les échantillons et traitements. Le pourcentage de réduction le plus élevé par les phages BC-S1 et BS-S2 a été trouvé sur des échantillons de lait pasteurisé, tandis que les phages ETEC-S3 et EHEC-S4 ont montré la réduction la plus élevée sur des échantillons de viande de poulet à 28 ° C de température de stockage.

Les bactériophages sont la forme de vie la plus abondante sur terre et peuvent être trouvés dans presque tous les habitats, tels que le sol, l'eau et la nourriture. Le sol près de l'élimination des déchets organiques a été utilisé comme échantillon car c'est une source idéale pour isoler les bactériophages car il contient un nombre élevé de bactéries diverses. Ainsi, la présence de ses bactériophages est potentielle. Il y a environ 1,5 × 108 bactériophages par gramme de sol agricole12.

Quatre bactériophages ont été récupérés avec succès, à savoir le phage BC-S1 contre B. cereus, le phage BS-S2 contre B. subtilis, le phage ETEC-S3 contre ETEC et le phage EHEC-S4 contre EHEC. Ces phages pourraient être considérés comme des bactériophages lytiques en raison de leur formation de plaques claires dans le test de superposition d'agar. Cependant, dans les zones où les bactériophages sont absents, les bactéries se développent jusqu'à la phase stationnaire et forment une couche opaque confluente ou "pelouse" dans la couche de gélose molle13. Certains critères requis pour l'application d'un bactériophage en tant qu'agent de lutte biologique sont obligatoirement lytiques, non transducteurs et sans gène de toxine pour garantir la sécurité14. Les bactériophages lytiques se répliquent en se fixant, en injectant de l'acide nucléique et en lysant la cellule hôte pour produire la descendance du phage. Les bactériophages "nouveau-nés" sont alors prêts à entamer un autre cycle en infectant une autre cellule bactérienne. Pendant le cycle lysogénique, les phages intègrent leur acide nucléique dans le chromosome de la cellule hôte et se répliquent avec lui en tant qu'unité sans détruire la cellule15. Par conséquent, les bactériophages devraient être obligatoirement lytiques pour réduire la puissance du transfert de gènes de toxines qui peut augmenter leur virulence16.

Connaître la concentration des bactériophages isolés est indispensable. Le titre des bactériophages est l'un des facteurs pouvant affecter leur efficacité dans les applications de phagothérapie. Une valeur de titre élevée indique une meilleure stabilité du phage. Les applications de bactériophages à usage thérapeutique nécessitent un titre élevé de phages lytiques (109 PFU/mL)17. Dans cette étude, le titre des bactériophages isolés variait de 105 à 1010 PFU/mL. Il est recommandé de rafraîchir régulièrement le bactériophage pour maintenir la stabilité du phage à un titre élevé, car un stockage prolongé peut entraîner une baisse du titre18.

La caractérisation du bactériophage par la détermination de la gamme d'hôtes est également un facteur dans l'évaluation de la capacité du phage isolé contre différentes souches de bactéries hôtes11. Le phage ETEC-S3 s'est avéré avoir la capacité d'infecter B. cereus et le phage EHEC-S4 peut infecter EPEC, mais les deux ont montré une faible efficacité. Tous les bactériophages isolés ont réalisé une gamme d'hôtes très spécifique ou étroite, y compris le phage BC-S1 ou BS-S2, car il a montré une activité lytique élevée uniquement pour l'hôte bactérien, tandis que plusieurs bactéries pathogènes ont montré une faible efficacité et n'ont montré aucune activité lytique sur le d'autres, encore plus. Généralement, les bactériophages nouvellement isolés ne peuvent infecter que des hôtes avec le même type de récepteur général que l'hôte isolé14. La localisation des récepteurs cellulaires varie en fonction du phage et de l'hôte. Il peut être situé sur la paroi cellulaire, les flagelles, les pili, les capsules ou les protéines de surface des cellules bactériennes. Le phage ne peut pas se lier à la cellule hôte si les récepteurs sont inaccessibles ou non complémentaires à la protéine de liaison au récepteur du phage19. D'autres études suggèrent que presque tous les bactériophages isolés à l'aide d'une seule souche hôte de bactéries peuvent être plus susceptibles d'avoir une gamme d'hôtes étroite plutôt que large. Dans de nombreux cas, cette propriété étroite est souhaitable car elle a généralement une grande spécificité pour l'hôte lui-même, empêchant la destruction d'autres espèces de bactéries et laissant le reste de l'hôte bactérien intact. Ce phage à gamme d'hôtes étroite est également essentiel pour le développement de cocktails de phages, ce qui élargit la gamme d'hôtes pour la thérapie par les phages. Dans ce cas, la caractérisation du phage individuel du cocktail est nécessaire14,20.

L'efficacité du placage (EOP) a été utilisée pour définir l'efficacité du bactériophage contre les bactéries cibles. Une valeur EOP de 0,5 à 1,0 est classée comme haute efficacité, une valeur EOP de 0,2 à 0,5 est classée comme efficacité moyenne, tandis qu'une valeur EOP de 0,001 à 0,2 est classée comme faible efficacité et une EOP inférieure à 0,001 est inefficace21. Selon le résultat, le phage EHEC-S4 a obtenu une efficacité supérieure à celle du phage ETEC-S3. Le phage ETEC-S3 a été considéré comme inefficace envers B. cereus, tandis que le phage EHEC-S4 a eu une faible efficacité envers EPEC. Les deux phages isolés ont montré une spécificité élevée car ils ont montré une activité élevée uniquement contre les hôtes bactériens. Une faible EOP peut être causée par l'action de systèmes de résistance de l'hôte bloquant le développement du virus intracellulaire ou par une mauvaise adsorption des bactériophages sur les cellules hôtes22.

La MOI est déterminée par le rapport PFU/CFU, qui ne compte que les phages adsorbés attachés aux bactéries infectées puis infectées23. La valeur MOI minimale doit être examinée pour déterminer la concentration efficace potentielle qui peut être utilisée. Dans cette étude, tous les phages isolés ont montré différentes MOI optimales pour inhiber ou lyser complètement chaque hôte. La valeur MOI minimale obtenue pour les phages BC-S1 et BS-S2 était de 0,1, la MOI du phage ETEC-S3 était de 0,001 et la MOI du phage EHEC-S4 était de 1. Le phage ETEC-S3 a montré la MOI la plus faible par rapport aux autres. , indiquant que le phage ETEC-S3 est considéré comme plus efficace car une concentration de phage plus faible est nécessaire pour réduire le nombre de bactéries. La valeur MOI efficace est affectée par les conditions environnementales telles que le nombre de phages infectants, le nombre de cellules cibles à attacher, ainsi que la vitesse et le temps alloués à l'attachement12,23. Les phages BC-S1, BS-S2 et EHEC-S4 ont donné un meilleur résultat d'activité lytique en utilisant des nombres de MOI plus élevés. La croissance bactérienne a diminué à mesure que le MOI augmentait, car une utilisation plus élevée du MOI augmente la probabilité que des particules de phage infectent leurs bactéries hôtes. Une valeur de MOI plus faible montrait toujours la réduction bien qu'elle ne puisse pas inhiber complètement la croissance de l'hôte bactérien. Une plus grande concentration de bactériophages signifie que plus de cellules peuvent être lysées, ce qui donne une activité lytique rapide24. Cependant, ces phages différaient du phage ETEC-S3, où une MOI supérieure à 0,001 ne pouvait pas inhiber complètement la croissance des cellules. La réduction bactérienne a été montrée dans les 6 premières heures d'incubation, puis les bactéries ont continué à se régénérer. Une concentration en phages trop élevée en termes de MOI peut conduire à une lyse bactérienne via l'action enzymatique des lysines du phage une fois les phages attachés à leurs récepteurs, sans même que de nouveaux virions n'accèdent à la cellule. Ainsi, l'infection productive des bactériophages est arrêtée, ne générant plus de virus pour envahir le reste de la population pathogène25.

La classification des bactériophages dépend de son type d'acide nucléique et de sa morphologie. Un bactériophage est composé d'une tête et d'une queue. La tête ou capside est une coque protéique qui enveloppe le matériel génétique en forme d'icosaèdre. Les queues ont généralement six fibres de queue qui varient en taille et retiennent les récepteurs protéiques pour reconnaître les sites de fixation à la surface des parois cellulaires bactériennes pour la fixation à des cellules hôtes spécifiques26,27. Les bactériophages à queue (Caudovirales) sont divisés en quatre familles en fonction de la forme de leur queue (ICTV). Les myoviridae ont une queue longue, rigide et contractile d'une longueur de 80 à 485 nm et le diamètre moyen de la tête est de 85 nm. Siphoviridae a une queue longue et flexible non contractile avec une longueur de 79 à 535 nm et un diamètre moyen de la tête de 55 nm. Les Podoviridae ont une queue courte non contractile inférieure à 40 nm de long et un diamètre moyen de la tête de 58 nm28. En outre, les Ackermannviridae nouvellement créés ont jusqu'à quatre protéines de pointe de queue et peuvent infecter un large éventail de bactéries Gram-négatives29. Dans cette étude, la morphologie isolée des bactériophages BC-S1 et ETEC-S3 a été analysée à l'aide de TEM. Sur la base du résultat, les deux phages ont montré une tête icosaédrique attachée à une queue contractile. On peut supposer que les deux phages appartiennent au membre de l'ordre des Caudovirales. L'analyse moléculaire du génome du bactériophage est nécessaire pour des recherches plus approfondies afin de connaître spécifiquement la classification et de s'assurer que ces phages ne contiennent pas de gènes associés à la virulence ainsi que des gènes de résistance aux antibiotiques30.

Étant donné que les bactériophages provoquent la mort bactérienne, leur utilisation potentielle en tant que conservateurs alimentaires est devenue de plus en plus attrayante. Dans cette recherche, les bactériophages BC-S1 et BS-S2 ont été appliqués sur du riz cuit et du lait pasteurisé pour contrôler la croissance de B. cereus et de B. subtilis, et les bactériophages ETEC-S3 et EHEC-S4 ont été appliqués sur de la viande de poulet et de la laitue fraîche pour contrôler Croissance ETEC et EHEC. Tous les phages isolés pourraient réduire considérablement leur population de bactéries hôtes dans chaque échantillon à toutes les températures de stockage. La température ambiante et le stockage à basse température ont été sélectionnés car il s'agissait généralement de la température courante utilisée pour stocker les aliments et les boissons pendant une courte période.

Dans l'ensemble, la réduction bactérienne dans les échantillons de lait pasteurisé était plus élevée que dans le riz cuit, et la réduction bactérienne dans les échantillons de viande de poulet était plus élevée que dans la laitue. Ces capacités de réduction peuvent être affectées par les matrices d'échantillons alimentaires. La diffusion et le contact limités des bactéries et des phages étaient responsables de la faible efficacité. Des particules de phages peuvent être nécessaires pour réduire la contamination bactérienne sur les surfaces alimentaires humides et dans les liquides par rapport à une matrice alimentaire plus sèche en raison de la "mobilité" accrue des phages en présence d'humidité. Le contact initial du bactériophage et de la bactérie se produit souvent par diffusion et mouvement brownien. Par conséquent, les échantillons liquides tels que le lait pasteurisé ont permis une plus grande diffusion des phages plutôt que sur la matrice solide comme le riz cuit en raison des mouvements restreints de la molécule de solvant28,31.

Le traitement pour la viande de poulet a montré une réduction plus élevée que la laitue en raison de ses jus naturels. Lorsque la viande de poulet n'a pas d'espace autour d'elle, la chaleur et l'humidité ne peuvent pas s'échapper, laissant le poulet cuire à la vapeur dans son propre jus. Les phages dans les échantillons de laitue sont probablement incapables d'atteindre et d'envahir les bactéries, étant donné que la laitue a une matrice alimentaire sèche. Le mouvement passif des phages à travers les surfaces alimentaires est limité en raison du manque d'humidité32. D'autre part, au même temps et à la même température, la réduction bactérienne dans la laitue était plus élevée par rapport à la viande de poulet dans le traitement utilisant le phage EHEC-S4. La situation est différente sur les aliments solides avec des surfaces planes comme la laitue, où la surface totale et sa capacité à absorber le liquide de la suspension de phages sont plus faciles que les surfaces inégales comme la viande de poulet. Les aliments avec une surface inégale et grande sont difficiles à traiter avec des phages car la distribution des phages est physiquement limitée pour atteindre toutes les cibles bactériennes. De plus, les bactéries cibles peuvent être intégrées dans la matrice alimentaire plutôt complexe, les protégeant des particules de phage diffusantes33.

De même, l'incubation à 28 ° C a montré une réduction bactérienne plus élevée qu'à 4 ° C d'incubation. La température peut également affecter l'activité des phages, où les phages dépendent de la croissance des hôtes bactériens pour leur réplication. B. cereus, B. subtilis et E. coli se développent dans la plage de température mésophile, avec un optimum à environ 37 °C. Une température de croissance optimale de l'hôte bactérien favorise une meilleure réplication des particules de phage. En revanche, à une température plus basse, le taux de réplication des phages était considérablement diminué ou stoppé en raison du taux de croissance plus faible de leurs hôtes34.

Tous les bactériophages isolés dans cette étude ont efficacement réduit la détérioration ciblée des aliments et les bactéries pathogènes d'origine alimentaire. Cependant, des études supplémentaires étaient nécessaires pour déterminer leurs activités contre d'autres agents pathogènes et leur stabilité à diverses conditions environnementales et caractériser leurs propriétés génomiques pour assurer leur innocuité s'ils veulent être utilisés comme alternative de conservation.

Les bactériophages ont été isolés du sol, puis enrichis et purifiés. La caractérisation des bactériophages isolés, y compris le titre, la gamme d'hôtes, l'efficacité du placage (EOP), la multiplicité inhibitrice minimale de l'infection (miMOI) et la morphologie ont été déterminées. L'application des bactériophages isolés à des échantillons alimentaires a également été évaluée.

B. cereus ATCC 10876, B. subtilis ATCC 6633, ETEC US Namru-1 et EHEC US Namru-1 ont été utilisés dans cette étude pour servir de souches hôtes pour l'isolement des bactériophages. Toutes les souches bactériennes ont été stockées dans 1,0 mL d'aliquotes de glycérol à 20 % (v/v) à - 80 °C. Les cultures bactériennes ont été inoculées sur des plaques de gélose Luria Bertani (LB) (Oxoid™) et ont été incubées à 37°C pendant une nuit. Les plaques ont été conservées à 4 °C et utilisées comme cultures de travail35.

Le sol près de l'élimination des déchets organiques a été utilisé comme échantillons qui ont été prélevés dans le village de Pakulonan Barat, sous-district de Kelapa Dua, district de Tangerang de la province de Banten, Indonésie. Les échantillons de sol ont été transportés au laboratoire et traités pour l'isolement des bactériophages.

Chaque souche bactérienne hôte a été cultivée dans du bouillon Luria Bertani (LB) (Oxoid™) jusqu'à la phase médiane (OD600 = 0,132) par incubation à 37 °C, 120 tr/min, pendant une nuit. Six grammes d'échantillon de sol et 300 μL de chaque culture bactérienne ont été ajoutés dans 30 mL de bouillon LB. Les échantillons ont été complétés avec 100 μL de 10 mM de CaCl2 et 100 μL de 0,5 mM de MgSO4 pour améliorer la croissance du bactériophage12 et ont été incubés à 37 °C, 150 tr/min, pendant la nuit. Les échantillons ont ensuite été centrifugés à 7000 × g pendant 15 min. Le surnageant a été filtré à l'aide d'un filtre à seringue jetable à pores de 0,22 μm (HIMEDIA) pour éliminer les cellules bactériennes restantes. Le filtrat a été centrifugé à nouveau à 7000 × g pendant 10 min et testé pour la présence de bactériophages en utilisant le test de superposition d'agar6,35. Le test de superposition d'agar a été effectué en versant de l'agar supérieur (LB composé de 0,6 % d'agar) sur l'agar inférieur (LB composé de 2 % d'agar), où 150 μL de filtrat de bactériophage, 150 μL de culture hôte bactérienne en phase intermédiaire, 50 μL de CaCl2 10 mM et 50 µL de MgSO4 0,5 mM ont été mélangés dans 4 ml de gélose molle LB fondue et versés sur une plaque de gélose LB, puis incubés à 37 °C pendant la nuit. Une formation de plaque claire a été observée36.

Les bactériophages lytiques isolés ont été purifiés en poignardant doucement la plaque transparente à l'aide d'une pointe stérile. La pointe a ensuite été placée dans 10 ml de bouillon LB et pipetée de haut en bas pour libérer les particules de bactériophage. Les bactériophages ont été enrichis en ajoutant 250 µL de culture hôte bactérienne en phase intermédiaire dans le bouillon LB et incubés à 37 °C pendant une nuit à 120 tr/min. Après enrichissement, le mélange a été centrifugé à 7000 × g pendant 15 min et le surnageant a été filtré à l'aide d'un filtre à membrane de taille de pores de 0,22 µm (HIMEDIA) pour obtenir un stock de bactériophages. Les filtrats ont été conservés dans une solution de Ringer (2,25 g de NaCl, 0,105 g de KCl, 0,12 g de CaCl2, 0,05 g de NaHCO3 dans 500 mL d'eau distillée) (Oxoid™) avec un rapport 1:1 (v/v) à 4 °C comme solution de travail pour une analyse plus approfondie37,38,39.

Les titres ont été déterminés à l'aide de la méthode de dosage par superposition d'agar37. Une série de dilutions au 1/10 de la solution de lysat de bactériophage a été réalisée à l'aide de tampon SM (chlorhydrate de Tris 50 mM (Tris-HCl) [pH 7,5], NaCl 0,1 M, sulfate de magnésium heptahydraté 8 mM (MgSO4•7H2O) et 0,01 % (w/ v) gélatine). Chaque dilution a été étalée selon le test de superposition d'agar et incubée à 37°C pendant une nuit. Le nombre de plaques visibles a été calculé entre 30 et 300 plaques exprimées en unité formant plaque par millilitre (PFU/mL)35.

La gamme d'hôtes de bactériophages isolés a été déterminée en utilisant différentes espèces de bactéries hôtes, notamment contre B. cereus ATCC 10876, B. subtilis ATCC 6633, ETEC US Namru-1, EHEC US Namru-2, EPEC de US-Namru 2 et V. cholerae ATCC 14033. Le bactériophage isolé a été testé contre les différents hôtes pour tester leur sensibilité avec le test de superposition d'agar et incubé à 37 °C pendant la nuit40.

L'EOP a été testée à l'aide d'un test de superposition d'agar et effectuée 3 fois de réplication et calculée en divisant le PFU moyen sur les bactéries cibles par le PFU moyen sur les bactéries hôtes21.

Les cultures hôtes bactériennes ont été cultivées jusqu'à la phase médiane et suspendues pour correspondre à la norme McFarland de 0,132. La culture hôte et le lysat de bactériophage ont été dilués pour contenir différents MOI de 0,00001 à 100. Chacun d'eux a été distribué 100 μL dans la plaque de microtitration à 96 puits, puis incubé à 37 ° C pendant 10 h. Les concentrations ont été déterminées toutes les 1 h à l'aide d'un lecteur de microplaques (Tecan Infinite® M200 PRO)41.

La morphologie des bactériophages isolés a été déterminée par microscopie électronique à transmission (MET) à l'Institut Eijkman de biologie moléculaire, Jakarta, Indonésie. Environ 10 μL de bactériophage ont été déposés sur une grille (400 mesh) et laissés pendant 30 s. Les échantillons de bactériophages ont été colorés négativement en utilisant 5 μL d'acétate d'uranyle à 2 % (p/v) sur des grilles revêtues de carbone. Les grilles ont été observées à l'aide de JEM-1010 TEM (JEOL, Tokyo, Japon) à un grossissement de × 30,00042,43.

Du riz cuit, du lait pasteurisé, de la viande de poulet et de la laitue fraîche ont été utilisés comme échantillons alimentaires. La viande de poulet crue a été coupée en morceaux (1 cm × 1 cm). Du riz cuit et de la viande de poulet crue ont été placés dans 50 ml de tubes Falcon (Corning®) pour environ 1 g pour chaque tube, tandis que du lait pasteurisé (1 ml) a été placé dans 15 ml de tubes Falcon (Corning®). Ces échantillons ont été stérilisés par autoclavage pendant 15 min à 121 °C pour tuer toutes les bactéries naturelles33. Pendant ce temps, les laitues fraîches ont été rincées à l'eau propre, puis tamponnées avec 96% d'alcool sur leurs surfaces. Les laitues ont été coupées en morceaux (1 cm x 1 cm) et placées dans des tubes Falcon de 50 mL (Corning®). Ensuite, les tubes ont été exposés à la lumière UV du flux d'air laminaire (ESCO) pendant environ 45 min44.

Après stérilisation, chaque échantillon de riz cuit et de lait pasteurisé a été inoculé avec 100 μL de suspensions de souches hôtes bactériennes en phase logarithmique moyenne (B. cereus et B. subtilis) et 100 μL de bactériophages isolés (BC-S1 et BS-S2) qui ont été dilués pour contenir un MOI de 0,1. Alors que chaque échantillon de viande de poulet et de laitue fraîche a été inoculé avec 100 μL de suspensions de souches hôtes bactériennes en phase intermédiaire (ETEC et EHEC) et 100 μL de bactériophages isolés (ETEC-S3 et EHEC-S4) qui ont été dilués pour contenir MOI 0,001 pour ETEC et MOI 1 pour EHEC. Tous les échantillons ont ensuite été incubés à 4 °C et 28 °C pendant une nuit45.

Après l'incubation, 10 ml de tampon SM ont été ajoutés à chaque échantillon et les tubes ont été vortexés pendant environ 3 min. Chaque échantillon a ensuite été dilué en série et étalé sur une plaque de gélose LB, incubé à 37 ° C pendant la nuit. Pour le contrôle positif, les échantillons alimentaires ont été inoculés uniquement avec la souche hôte. Pour le contrôle négatif, les échantillons alimentaires ont été inoculés uniquement avec du lysat de bactériophage isolé. Les colonies ont été comptées entre 30 et 300 colonies exprimées en unité formant colonie par millilitre (UFC/mL)46.

Les données ont été recueillies après 3 répétitions et une analyse statistique a été effectuée à l'aide d'une ANOVA unidirectionnelle suivie du test Tukey's-B (SPSS Inc. IBM corporation). Le niveau de différence a été défini à P ≤ 0,05, et différentes lettres dans chaque colonne indiquaient des différences significatives par rapport aux autres échantillons. Pour l'appariement contrôle-traitement de chaque échantillon, sa réduction significative a été déterminée à l'aide du test T pour échantillons appariés avec le niveau de différences défini à P ≤ 0,0547.

Quatre bactériophages lytiques, BC-S1, BS-S2, ETEC-S3 et EHEC-S4 ont été récupérés avec succès à partir d'échantillons de sol. Ils étaient considérés comme des phages hautement spécifiques avec un spectre étroit de gamme d'hôtes, où le phage ETEC-S3 s'est avéré inefficace contre B. cereus et le phage EHEC-S4 avait une faible efficacité contre EPEC. Cette propriété étroite est souhaitable car elle a généralement une grande spécificité pour l'hôte. En utilisant TEM, les phages BC-S1 et BS-S2 pourraient être classés comme l'un des membres Caudovirales. Ces phages ont montré une réduction significative des échantillons d'aliments sur miMOI de 0,1 pour les phages BC-S1 et BS-S2, miMOI 0,001 pour le phage ETEC-S3 et miMOI 1 pour le phage EHEC-S4 à 4 ° C et 28 ° C température de stockage . Ces résultats ont montré l'efficacité potentielle du bactériophage dans la réduction de la détérioration ciblée des aliments et des bactéries d'origine alimentaire. Ainsi, il est également prometteur d'être étudié plus avant.

Cette étude n'a examiné qu'une partie de la détérioration des aliments et des bactéries pathogènes d'origine alimentaire. De plus, les aliments testés sont limités. Par conséquent, d'autres microbes et échantillons d'aliments doivent être explorés. D'autre part, il convient également de caractériser davantage leurs propriétés génomiques telles que le facteur de virulence et les gènes de résistance aux antibiotiques, ainsi que la survie de ce bactériophage dans diverses conditions de transformation des aliments.

Les données de cette étude sont disponibles auprès de l'auteur correspondant sur demande.

Escherichia coli entérohémorragique

Efficacité du placage

Escherichia coli entéropathogène

Escherichia coli entérotoxinogène

Multiplicité minimale inhibitrice d'infection

Tampon sodium-magnésium

La microscopie électronique à transmission

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Nous tenons à remercier le ministère de l'Éducation d'Indonésie qui a financé cette recherche par le biais de la subvention de recherche compétitive nationale 2021.

Cette étude a été financée par le ministère de l'Éducation d'Indonésie-2021. Le bailleur de fonds n'a aucune contribution dans cette étude.

Département de technologie alimentaire, Faculté de biotechnologie, Université catholique Atma Jaya d'Indonésie, Jenderal Sudirman 51 Street, South Jakarta, DKI Jakarta, 12930, Indonésie

Fille de Christy Artawinata & Sesilia Lorraine

Département de maîtrise en biotechnologie, Faculté de biotechnologie, Université catholique Atma Jaya d'Indonésie, Jenderal Sudirman 51 Street, South Jakarta, DKI Jakarta, 12930, Indonésie

Diana Elizabeth Watrangi

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Chercheur personnel DEW, projet de recherche en conception et design, interprétation de données et conseil en recherche. PCA et SL ont mené la recherche, collecté les données, analysé et traité les données et préparé le manuscrit. Tous les auteurs ont lu et approuvé le manuscrit final.

Correspondance à Diana Elizabeth Waturangi.

Les auteurs ne déclarent aucun intérêt concurrent.

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Réimpressions et autorisations

Artawinata, PC, Lorraine, S. & Waturangi, DE Isolement et caractérisation des bactériophages du sol contre la détérioration des aliments et les bactéries pathogènes d'origine alimentaire. Sci Rep 13, 9282 (2023). https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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Reçu : 09 décembre 2022

Accepté : 06 juin 2023

Publié: 07 juin 2023

DOI : https://doi.org/10.1038/s41598-023-36591-6

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